ATAC-Seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing） 是2013年由斯坦福大学的研究人员开发的用于研究染色质可及性（通常也理解为染色质的开放性）的方法，原理是通过转座酶Tn5容易结合在开放染色质的特性，然后对Tn5酶捕获到的DNA序列进行测序。ATAC-Seq由于所需细胞量少，实验简单，可以在全基因组范围内检测染色质的开放状态，已经成为研究染色质开放性的首选技术方法。 目前，该技术被用于测定特定时空下基因组中所有处于开放状态的序列，分析调控元件，揭示转录因子结合位点以及核小体位置，从而为研究精细化基因表达的调控、DNA印记等提供有效的方法。
胰岛素分泌受损是2型糖尿病（T2D）的标志，而染色质结构的改变可能导致这种疾病。因此，本案例使用ATAC测序剖析T2D和非糖尿病供体胰岛的染色质开放区域，以研究T2D对人类胰岛开放染色质的影响。
瑞典乌普萨拉大学北欧胰岛移植网络的9例非糖尿病供体（对照组）和6名被诊断为T2D供体（实验组）
分离、培养胰岛细胞；取约30个新鲜胰岛冷冻（5个供体）或立即用于ATAC测序（5个供体）；测序数据整理分析；胰岛的RNA-seq；ATAC-seq数据与公共ChIP-seq数据集联合分析。
1. 绘制人类胰岛开放染色质图谱
非糖尿病和T2D组中分别鉴定出57,105和53,284个peaks，一些序列被富集到与胰岛发育分化有关的基因上，例如PDX-1和FOXA2（图1）。其中，大部分peaks的位置接近转录起始位点（TSS）（图2a），在糖尿病和非糖尿病供体的胰岛中，染色质开放区域的基因组分布相似（图2b, c）。
2. 增强子元件和组蛋白修饰注释分析
与活性染色质相关的组蛋白标记（H3K4me1、H3K4me3和H3K27ac）在实验组胰岛peak中富集，但只有一小部分异染色质相关的组蛋白标记（H3K27me3和H3K9me3）与peak重叠（图3），且T2D供体胰岛中的组蛋白修饰和peak之间的重叠与之类似。此外，T2D相关的差异性甲基化区域（DMRs）位于人类胰岛的7412个开放染色质区域，包括PDX1和SLC20A2标注的区域。
3. 转录因子和转录本注释分析
通过ATAC-seq开放染色质区域和胰岛特异性转录因子（TF）相关基因的比对分析，发现研究所涉及的TF相关基因富集于胰岛peaks。此外，本研究共获得60,517个转录本，分为未表达（38,428个）、低表达（7,363）、中表达（7,363）和高表达（7,363）转录本。ATAC-seq 分析中的peaks大部分被注释到高表达的转录本上。
4. T2D和非糖尿病供体的胰岛开放染色质区域差异分析
有1078个peaks在T2D和非糖尿病胰岛供体之间存在差异，其在基因组不同区域的分布比例见图4a，其中有1044个peaks在T2D供体中富集。一些关键TF特异性motif显著富集在peak中（图4b）。
Bysani, M., Agren, R., Davegrdh, C., et al., ATAC-seq reveals alterations in open chromatin in pancreatic islets from subjects with type 2 diabetes. Sci Rep 9, 7785 (2019). doi：10.1038/s41598-019-44076-8
细胞分化由转录因子（TF）活性变化和转录的改变所驱动。目前，可通过探测染色质可及性去推断细胞类型间TF结合的差异研究这一过程。本研究采用转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）分析，以描述拟南芥中茎尖分生组织（SAM）干细胞和分化的叶肉细胞在染色质可及性和TF调节网络方面的差异。
经实验室培养、转化的拟南芥植株
按一定条件培养植物；构建2种质粒（分别为CLV3和RBC基因与NTF基因的结合体）；将质粒整合到植物中表达；拍摄记录转化后的植物顶端分生组织或叶片以确定NTF蛋白的表达和定位；用INTACT法分离细胞核；进行ATAC测序；数据分析与可视化。
1. 主要不同细胞的染色质开放区域注释
干细胞和叶肉细胞可富集到22,961个相同的THSs，单独在两类细胞表达的转座敏感位点THSs数量分别为5,283和2215个（图1b）。干细胞和叶肉细胞THSs在基因组不同区域上的分布类似（图1c）。此外，两类细胞的表达谱显示，干细胞的ATAC-seq信号在THSs中心区域最强，并向两侧急剧下降。且在叶肉细胞THSs表达较少的区域也能呈现较高的开放性，间接表明在叶肉细胞的染色质可及区域在干细胞也可获得，反之则不然。
2. 细胞富集型THS相关基因分析
结果显示染色质开放性更高的细胞类型可以富集到更多的THSs，位于这些区域附近的基因更有可能呈现出高表达。而与这些基因相关的ATAC-seq peaks大部分位于转录起始位点上游和转录终止位点下游（图2）。
3. motif分析与转录调控网络
本研究分别在干细胞和叶肉细胞富集到23个和129个差异表达转录因子（图3a）。结合干细胞IDD/GATA调控和在叶肉细胞高表达的4个TFs，确定其靶基因并绘制调控网络图（图3b），该图描述了TF间复杂的相互作用（图4）。
Sijacic P, Bajic M, McKinney EC, Meagher RB, Deal RB. Changes in chromatin accessibility between Arabidopsis stem cells and mesophyll cells illuminate cell type-specific transcription factor networks. Plant J. 2018;94(2):215-231. doi:10.1111/tpj.13882
ChIP-seq 是获取已知蛋白（转录因子）结合位点的方法，ATAC-seq主要是基于开放区域的motif基因序列来预测可能结合的转录因子。ATAC-Seq对样本起始量需求更少（500-50000），获取的信息更多，不但可做全基因组活性图谱，还可以做核小体定位和转录因子结合分析。
ATAC-Seq对细胞活性要求较高，送样前最好检测下细胞活性，尽量送活性（大于70%）较高的新鲜细胞，组织样本需先处理成细胞悬液, 组织样本也可承接，但需要提前评估。 风险样本类型：a) 结缔组织等骨细胞和纤维含量高的动物样本；b)根茎等纤维含量高、种子果实等糖含量高的植物组织样本，这些物质会降低细胞核提取效率；以及冻存时间超过2个月的样本。
建议每个分组中设置至少3个生物学重复，来获得更准确的结果，如生物重复间个体差异大的，可增加生物学重复数量。取样过程中，应减少人为造成的样品间差异，具体可以采取如下措施：取样时间、部位、处理条件、性别、年龄、操作过程等方面尽可能保持一致，否则会影响实验结果的可重复性和可信度。