化疗耐药是骨肉瘤（OS）治疗中遇到的一个巨大障碍。蛋白质编码的mRNA，以及非编码RNA（ncRNA），包括长ncRNA（lncRNA）、环状RNA（circRNA）和microRNA（miRNA），已被证明在癌症生物学调控中起着重要作用。但是，竞争内源RNA（ceRNA）调控的mRNAs与ncRNAs在OS化疗耐药中的关系尚不清楚。

三株人OS细胞系（MG63、KHOS、U2OS）以及来自80例原发性OS患者的组织样本

实验设置三对配对的多药化学抵抗和化学敏感骨肉瘤细胞系实验组，并对其进行全转录测序,其结果用于预测ceRNA网络。使用qRT-PCR，RNA验证免疫沉淀（RIP）、RNA pull-down分析和双重荧光素酶报告基因检测对ceRNA调控网络进行验证

1.lncRNAs、circRNA、miRNAs及 mRNAs表达谱比较

对化疗耐药组和化疗敏感组的lncRNAs、circRNAs、 miRNAs、 mRNAs分别进行差异分析，分别发现339、80、21、2606个差异表达RNA。其中上、下调幅度最大的lncRNA分为lnc-DNMT1-2:1和lnc-RPLP0-4:1。此外，circRNA、miRNA和mRNA上调最多的是 hsa_circ_0004674，hsa-miR-337-3p和C6orf106，而下调最多分别为hsa_-circ_0068458，hsa-miR-203a-3p及AKR1C2（表1）。

2.lncRNAs、circRNA、miRNAs及 mRNAs参与的KEGG/GO通路

GO富集分析表明lncRNA-miRNA网络主要与膜内骨化、胶原型XIV三聚体和角蛋白丝结合通路有关。此外，差异mRNAs富集的KEGG 通路中有20条参与lncRNA-miRNA网络。化学致癌，调节肌动蛋白细胞骨架和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-Akt信通路富集基因数量最多。

3.lncRNA-miRNA-mRNA和circRNA-miRNA-mRNA调控网络

本研究利用11个基本富集在所有通路中的差异mRNAs构建了1,269个lncRNA-miRNA-mRNA途径（图1A）和90个circRNA-miR- NA-mRNA途径（图1B）。其中有3个circRNAs和11个lncRNAs共享相同miRNA/mRNA，8个circRNAs和132个lncRNAs共享相同mRNA，而不是相同miRNA。

4.随机筛选两条通路的验证

结合q PCR，RIP、RNApull-down实验，结果显示hsa-miR-200b-3p靶向lncRNA:MEG3，并与其3’UTR分子结合。 miR-200b-3p可以靶向具有互补结合位点的AKT22 mRNA 3’UTR（图2P）。荧光素酶报告基因分析也验证了miR-200b-3p和AKT2之间的分子相互作用（图2Q）。此外，hsa_circ_0001258与has-miR-744-3p有8个结合位点（图2L），而hsa-miR-744-3p可以靶向GSTM2 mRNA的 3’UTR。荧光素酶报告基因分析表明hsa_circ_0001258可与hsa-miR-744-3p结合，hsa-miR-744-3p可与AKT2 mRNA的3’ UTR结合。上述结果确定了lncRNA MEG3/hsamiR-200b-3p/AKT2h和hsa_circ_0001258 / hsa-miR-744-3p/GSTM2通路OS化疗耐药中的作用。

玉米赤霉烯酮（ZEA）是一种存在于动物饲料中类似于雌激素的霉菌毒素，具有很强的生殖毒性。卵巢颗粒细胞（GCs）在猪卵泡发育成熟过程中起着至关重要的作用，然而，玉米赤霉烯酮影响卵巢颗粒细胞发育的内源竞争RNA（ceRNA）网络仍有待进一步研究。本研究首次采用全转录组测序技术来探索ZEA在猪GC上的毒理学分子机制。

取母猪卵巢并用生理盐水处理，收集卵泡液并分离卵巢颗粒细胞

以原代培养的猪卵巢颗粒细胞为模型，设立玉米赤霉烯酮（ZEA）对照组、高、低剂量组。对三组细胞进行全转录组测序，探究ZEA影响猪卵巢颗粒细胞相关靶基因的内源竞争RNA网络，并将该结果与qRT-PCR，免疫荧光和Western Blotting结果互相验证。

1. ZEA对卵巢颗粒细胞的毒性

免疫荧光结果显示随ZEA浓度增加，细胞凋亡率逐渐升高。猪卵巢颗粒细胞的细胞周期被ZEA影响并阻滞在G2/M期。

2. ZEA上调与细胞周期相关的基因表达

ZEA会影响一些与细胞周期停滞相关的基因的表达，包括CDK1，CCNB1，CDC25A和CDC25C，该结论与qRT-PCR，免疫荧光和Western Blotting的结果一致。此外，基因组富集分析（GSEA）显示，与对照组相比，通路HALLMARK_G2M_CHECKPOINT富集在30 mM ZEA治疗组中（图1）。且与G2/M checkpoint有关的基因集在30 mM ZEA治疗组中高度表达。在细胞周期通路中富集的差异mRNAs主要参与7条KEGG通路，如图2所示。

3. ceRNA网络构建

Chord图显示了全基因组分布的差异mRNA/miRNA/lncRNAs（图3A）。有差异mRNA分布的X和3号染色体上（红色）上没有发现差异miRNA/lncRNA。此外，差异mRNA的总数大于差异miRNA/lncRNA的总数，这表明ncRNA在生命活动中起着重要作用。根据 mRNA-miRNA，mRNA-lncRNA和miRNA-lncRNA的靶向关系构建ceRNA网络（图3B），此ceRNA网络进一步证明ncRNA参与编码 RNA的调控，并参与细胞生理活性的调控。

全转录组建立两种文库：1. 小RNA文库，采用切胶富集小RNA片段建库模式，进行SE75测序，得到10-20 M clean reads。2. lncRNA文库，采用去核糖体链特异性建库模式，进行PE150测序模式，数据量10 G。

全转录测序可同时分析mRNA、LncRNA、circRNA和microRNA，解析RNA间相互作用及共表达调控网络，并且进行竞争性内源RNA（ceRNA）分析

可以，lnc RNA建库模式采用去核糖体链特异性方式建库，并打断RNA测序，相当于获得全部RNA，因此可以将测序结果比对到环状RNA数据库，并统计circRNA表达情况。