产品介绍

环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类特殊的内源非编码RNA,它大量存在于真核细胞胞质内,主要由pre-mRNA在可变剪接的过程中,将上游exon的5’端与下游exon的3’端剪接到一起,形成的首尾相接的环状RNA分子。在功能上,circRNA分子富含microRNA(miRNA)结合位点,充当分子“海绵”( miRNA sponge)的作用,进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用,升高靶基因的表达水平;在细胞生长发育,功能代谢和某些病理反应中发挥重要的调控作用。例如,circRNA可以作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)结合胞内miRNA,通过circRNA-miRNA-mRNA的途径来阻断miRNA对其靶基因的抑制作用。除此以外,circRNA也具有调控其他类型RNA、调节蛋白质活性等功能。

circRNA测序-产品应用

实验流程

circRNA测序-实验流程

分析内容

circRNA测序-分析内容

案例解析
案例 1

非线性RNA表达研究老年痴呆症临床和神经病理相关

期刊:Nature Neuroscience 影响因子:20.071 发表时间:2019年11月

研究背景

circRNA在神经系统中高度表达,且在突触中富集。在大脑中,circRNA的表达可以独立于其线性转录表达,并且可能是一个基因中表达量最高的亚型。脑内circRNA在发育和对神经元兴奋的反应中也受到一定程度的调控。先前对阿兹海默症(AD)的研究主要集中于探究线性转录本(主要是mRNA)的差异表达,以此揭示该疾病的发病机制和潜在的治疗目标。本研究将关注AD疾病的环形转录本的表达差异,进而获取对AD有效的治疗策略。

样品来源

共计96例Dicovery数据库中的AD和对照样本,以及来自MSBB数据库的195例样本

方案设计

对来自Discovery数据库实验组(83例)和对照组(13例)样本和来自MSBB数据库样本联合进行circRNA的生物学信息分析

主要结果

1. circRNA差异表达分析

使用DESeq2软件对AD病例及对照组进行circRNA差异表达分析,并与临床AD定量指征—Braak评分和临床痴呆评分进行相关性分析。结果显示,在discovery数据库中共鉴定出37个与至少一个AD性状显著相关的circRNA,而在MSBB数据库中分析发现164个与至少一个AD 性状显著相关的circRNA,且两者结果高度一致。表明circRNA的表达与AD的诊断、临床痴呆的严重程度和神经病理学的严重程度之间存在显著的相关性(图1)。

2. circRNA的表达是否在AD实质性症状出现前发生变化,以及这些变化是否局限于随机发生的AD

实验将circRNA分析扩展到症状出现前的AD样本(已有神经病理学证实,但还未出现明显症状,CDR ≤0.5)和常染色体显性遗传AD样本(ADAD),结果显示,在AD症状出现之前,circRNA在多个皮层区域表达出现早期变化,并且circRNA表达的变化在ADAD的情况下也会发生,而且即使根据神经病理学的严重程度进行调整,其变化幅度也只会更大。

3. AD相关circRNA的AD相关性和潜在的疾病影响机制

通过相对重要性分析、共表达网络分析和miRNA结合位点预测分析,与已知的两个因素-APOE4等位基因的数量(AD最常用的遗传风险因子)和神经元估计比例相比,circRNA的变化能更好的反映AD特征(图2);此外,AD相关的circRNA与已知的AD基因存在共表达关系,并且这些circRNA存在潜在的microRNA结合位点,可以用于预测以AD基因为靶点的microRNA(图3)。

circRNA测序-案例1

参考文献

Dube U, Del-Aguila JL, Li Z, et al. An atlas of cortical circular RNA expression in Alzheimer disease brains demonstrates clinical and pathological associations. Nat Neurosci. 2019;22(11):1903-1912. doi:10.1038/s41593-019-0501-5

案例 2

探究与湖羊毛羔皮不同毛型相关circRNA的表达信号

期刊:Genomics 影响因子:6.205 发表时间:2020年5月

研究背景

湖羊以其水波纹似的毛闻名于世,其毛类型和分布位置是评估羊毛质量的重要因素。根据毛卷曲度和宽度,羊毛被分为四个等级包括小波浪、中波浪、大波浪和直形羊毛。其中以小波浪为最佳,直型为最次。已有研究表明circRNA参与大量细胞和生物学过程,但却缺乏与湖羊毛囊发育关联的circRNA研究。

样品来源

采集来自江苏苏州农场6只两日龄全同胞湖羊羔的背部毛根

方案设计

采集6只湖羊羔的背部毛根,根据毛型分为直毛组和小波浪组。当羊毛收集至背侧1/3面积时,提取毛根RNA并进行IncRNA测序,后对湖羊不同花纹羔羊皮毛囊中的差异表达lncRNAs进行分析。

主要结果

1. circRNA差异表达分析

在小波浪型和直形羊毛组的差异分析中共鉴定到55个上调和59个下调的差异circRNAs。其中circSMAD5,circSMD1和circFGFR2的管家基因分别对应Smad5,Smad1和FGFR2。Smad5和Smad1是TGF-β信号通路中的重要基因,这些circRNA可能与TGF-β信号通路有关,甚至与毛囊的生长和发育有关。通过qRT-PCR技术在mRNA水平进行验证,PCR定量结果与RNA-seq结果高度一致。

2. 管家基因的GO与KEGG富集分析

GO富集分析表明,差异circRNAs的宿主基因被富集到2,252个功能亚类,其中有325个显著差异的GO通路。宿主基因的KEGG富集分析注释到64种通路,包括代谢通路(oas01100),TGF-β信号通路(oas04350),ErbB 信号通路(oas04012)等。其中 TGF-β途径,Notch途径和Wnt途径均参与毛囊的生长和发育。

3. 预测circRNAs和miRNAs之间靶向关系

利用MiRanda软件预测miRNA与circRNA的结合位点。结果表明,有129个miRNA可能与114个差异circRNA结合(图3)。相同circRNA上有多个miRNA结合位点,且相同miRNA也靶向多个circRNA。其中miR-10a,miR-125b, miR-143,miR-let-7a,miR-199a-3p,miR-200a,miR-200b对毛囊的生长和发育具有重要影响,它们的靶circRNA可能参与了毛囊的生长和发育。

4. 鉴定circRNAs的编码潜能

使用IRESfinder分析环状RNA的蛋白编码潜能,得到3,556个得分大于0.5的circRNAs。在此基础上,分别使用CPC,CNCI和PFAM软件鉴定了39,307个和2,019个具有编码潜能的circRNA。最终,通过三种软件同时鉴定了11个具有编码潜能的circRNAs。

circRNAseq_案例2

参考文献

Lv X, Chen W, Sun W, et al. Expression profile analysis to identify circular RNA expression signatures in hair follicle of Hu sheep lambskin [published online ahead of print, 2020 Aug 5]. Genomics. 2020;S0888-7543(20)30610-8. doi:10.1016/j.ygeno.2020.07.046

送样建议

circRNAseq_送样建议

常见问题
Q1. circRNA测序是单独使用circRNA建库吗?

在建库时,先去除rRNA并用RNase R酶处理去除线性RNA,而闭合环状的circRNA被保留用于后续测序。

Q2. IncRNA测序中circRNA分析与circRNA的 R酶富集建库测序分析的结果有什么区别?

采用R酶富集circRNA建库测序鉴定的circRNA数量在2-3万个,而采用IncRNA测序分析中的circRNA数量是R酶富集建库的十分之一。如果客户集中关注circRNA,推荐circRNA的R酶富集建库方法。

Q3. circRNA测序推荐检测数据量?

单个circRNA 测序推荐10 G数据量,采用Illumina测序PE150 策略。