产品介绍

LncRNA是一类超过200 nt的RNA分子,序列较为保守,通常具有polyA尾巴与启动子结构。其在分化过程中有动态的表达与不同的剪接方式,但它们并不编码蛋白,而是在表观遗传、转录以及转录后水平调控基因表达。lncRNA参与了X染色体沉默,基因组印记以及染色体修饰,转录激活,转录干扰,核内运输等多种重要的调控过程。且大多数的lncRNAs在组织分化发育过程中具有明显的时空表达特异性,且在不同疾病中呈现特异性表达方式,因此广泛应用于疾病机制研究,与人类疾病的发生、发展、防治都有密切关系。

lncRNAseq_产品应用

实验流程

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分析内容

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案例解析
案例 1

鉴定晚期前列腺癌中与雄激素受体因子相关的长非编码RNA

期刊:Communications Biology 影响因子:4.165 发表时间:2020年6月

研究背景

前列腺癌近年来在男性中的发病率呈不断上升势态,严重威胁男性健康,晚期前列腺癌发生转移或者去势抵抗后整体预后更差。长非编码(lnc)RNA在包括前列腺癌细胞在内的癌细胞中具有多种功能,例如表观和基因调控。已有研究报道由lncRNA介导的RNA结合蛋白或转录因子与前列腺癌特定的基因组区域关联。然而,去势抵抗性前列腺癌(CPRC)的分子细胞机制尚不清楚。

样品来源及方案设计

对六例前列腺良性增生,八例局限性前列腺,和六例CPRC癌组织提取RNA并开展RNA测序,联合三类前列腺癌细胞系的ChIP测序数据与RNA测序数据鉴定由雄激素(AR)或其受体调控的AR结合基因。之后用qRT-PCR和western blot来验证雄激素受体阳性前列腺癌细胞中AR的调控和CRPC模型细胞系的AR表达,使用RNA免疫沉淀分析剪接因子与CPRP组织中lncRNA的相互作用。

主要结果

1. CRPC发展中相关基因表达谱

为探究参与前列腺癌发展的基因信号,本研究将CRPC样本与前列腺增生和局限性前列腺癌组织比较,转录本表达量上调的基因归类于Type_A。其中代表性的CRPC标记基因有PCAT, TRIM25/Efp, EZH2, UBE2C和AR(图1)。对1679个Type_A基因功能富集,富集的KEGG通路参与生物学活动,包括DNA复制,细胞周期,剪接和氧化磷酸化。

2. CRPC特异性的AR转录programme

使用ChIP-seq和RNA-seq数据联合分析鉴定三种前列腺癌细胞系中雄激素或受AR调控的AR结合基因。在LNCaP和22Rv1细胞中,分别发现了1748、717个基因被AR调控,在VCaP细胞中AR调控基因大约是前者一半。而从前列腺癌发展至CRPC,AR靶基因的表达具有显著的异质性。在这些AR调控的基因中,发现了CRPC特异性标记基因,例如UBE2C、CDK1和EZH2。在这些基因中,活性启动子和增强子标 记(H3K4me3,AcH3)在AR结合序列显著富集(图2)。

3. 鉴定CRPC中AR调控的lncRNAs

研究发现了AR调控的lncRNA,即CRPC-Lncs(ARL- NC1, HOTAIR, PCAT1),它们在CRPC组织中高度表达。值得注意的是,其中两个lncRNAs(CRPC-Lnc#6: PRKAG2-AS1和#9:HOXC-AS1)的沉默可使CRPC肿瘤生长速度放慢,这显示出AR和AR变体表达的抑制作用。从机理上讲,剪接因子U2AF2活性取决于CRPC-Lnc#6的表达水平,该因子参与亚细胞定位(图3)。该研究突出了可作为参AR考调文节剂献以及CRPC中潜在生物标记物的lncRNA簇。

lncRNAseq_案例1

参考文献

Takayama KI, Fujimura T, Suzuki Y, Inoue S. Identification of long non-coding RNAs in advanced prostate cancer associated with androgen receptor splicing factors. Commun Biol. 2020;3(1):393. Published 2020 Jul 23. doi:10.1038/s42003-020-01120-y

案例 2

鉴定与小鼠年龄相关性听力损失的潜在lncRNA

期刊:Aging 影响因子:5.515 发表时间:2020年3月

研究背景

年龄相关性听力损失(AHL),也被称为老年性耳聋,其特征是由于年龄增长,耳蜗毛细胞、螺旋神经节神经元和血管纹细胞的不可逆性 损伤。lncRNAs通过调节神经元细胞的病理蛋白和离子通道参与神经衰老调控。目前还没有研究指出年龄相关性神经疾病AHL与lncRNAs是否存在关联。本研究探讨了lncRNAs是否参与调控AHL。

样品来源

实验将C57BL/6J小鼠分为两组:6周龄小鼠组和1岁龄小鼠组。细胞实验采用HEI-OC1细胞系

方案设计

提取六周龄和一岁龄小鼠耳蜗组织RNA并测序,分析两组lncRNA差异表达。使用qRT-PCR和western blot验证lncRNA的表达量。最后使用HEI-OC1细胞并敲除靶向 lncRNA NONMMUT010961.2。

主要结果

1. 耳蜗组织LncRNAs/mRNAs差异分析

本研究通过RNA序列分析,分析了lncRNAs和mRNAs在6周龄和1岁龄C57BL/6J小鼠耳蜗中的差异表达。我们发现这两组中分别有738 和2033个lncRNAs和mRNAs差异表达(FDR < 0.05)。本实验关注的与听力损失相关的已知基因和RNA序列中差异表达的34个mRNAs的重合,囊括了声音的感官知觉通路中(GO:0007605)的所有29个基因(图1)。

2. mRNA-lncRNA 共表达网络

为了鉴定与AHL相关的lncRNAs,基于Spearman相关性分析和共表达网络分析,选择了11个同时与听力损失和氧化应激细胞凋亡有关 的lncRNAs来验证RNA-seq数据的可靠性。这11种lncRNA与参与听力损失和氧化应激通路的靶向mRNA的互作如图2所示。结果表明,在

3. qRT-PCR验证lncRNA表达及潜在靶向mRNAs

用qRT-PCR方法验证lncRNAs在AHL动物模型和细胞模型中的表达水平。在这些lncRNAs中,有4个在AHL的动物和细胞模型中都有显著表达差异,其中lncRNA NONMMUT010961.2的差异最为显著。而敲除lncRNA NONMMUT010961.2后,与氧化应激和凋亡相关基因Ar和听力损失相关基因Hgf在HEI-OC1细胞中的表达显著降低(图3)。因此,lncRNAs NONMMUT010961.2可能与AHL相关,这为AHL提供一种新的治疗方法。

lncRNAseq案例2

参考文献

Zhao T, Liu X, Sun Z, et al. RNA-seq analysis of potential lncRNAs for age-related hearing loss in a mouse model. Aging (Albany NY). 2020;12(8):7491-7510. doi:10.18632/aging.103103

送样建议

lncRNAseq_送样建议

常见问题
Q1. lncRNA 测序对物种有什么要求?

做lncRNA 测序要求物种具有参考基因组且具有完整注释。

Q2. lncRNA 测序建库与转录组测序有什么不同?

常规转录组测序利用mRNA具有Ploy A尾巴的特性,使用oligo dT方法富集mRNA。而lncRNA建库则是去除rRNA构建链特异性文库,该文库可以区分转录本的正反链,挖掘顺式天然反义转录本,使反义转录本定量更加准确。

Q3. lncRNA 测序数据中是否同时有lncRNA和mRNA的表达信息?

IncRNA测序可以同时获得 lncRNA和 mRNA表达量,因此对于有参考基因组且注释完整的物种,选择lncRNA 测序,可同时获得lncRNA和mRNA的表达量。