16S/18S/ITS/功能基因多样性测序
产品介绍

扩增子测序是利用二/三代测序平台,对16S rDNA/18S rDNA/ITS/功能基因等特定产物进行高通量测序,突破传统微生物不可培养的缺点,获得环境样本中的微生物群落结构、进化关系以及微生物与环境相关性等信息。

16S/18S rDNA包含可变区和保守区,原核微生物的16S rDNA是细菌分类学研究中最常用的“分子钟”,基因长度约为1500 bp,真核微生物18S rDNA基因长度约为1500-2000 bp。保守区在菌种间差异不大,可反映物种间的亲缘关系,高变区具有属或种的特异性,根据物种亲缘关系不同而有一定的差异。

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案例解析
案例 1

特异性肠道微生物群特征预测早期肺癌

期刊:Gut Microbes 影响因子:8.640 发表时间:2020年4月

研究背景

大多数肺癌患者在疾病晚期才被初步诊断,常伴有预后不良。因此,肺癌的早期诊断在疾病治疗,提高患者生存率,以及开发敏感性和特异性高的非侵入性生物标志物具有重要的临床意义。最近的研究揭示了肠道微生物群和肺部疾病之间具有潜在联系,如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)和呼吸道感染,但是肺癌中的肠道菌群谱仍然未知。

样品来源

42名早期肺癌患者和65名健康人群的粪便样本

方案设计

通过16S rRNA基因测序分析疾病组和对照组的肠道菌群的组成,找到组间差异菌群;基于候选OTU构建初始支持向量机(SVM)模型预测疾病状态;用验证队列检验模型的预测能力,进一步构建临床指标“患者鉴别指数”( PDI),检验模型。

主要结果

1. 肺癌患者的肠道微生物特征

肺癌组与健康对照组的α多样性无显著差异,主坐标分析和ANOSIM分析显示微生物组组成和丰度存在显著差异。在肺癌患者中,共有3个门13属20种的丰度显著降低,而4个门11属15种的丰度则升高。尽管在癌症组中存在一些特有的低丰度门,但在厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门等几个高丰度门之间也存在显著差异。

2. 肺癌预测肠道微生物特征的鉴定

使用前30名候选OTU构建一个初始支持向量机模型来预测疾病状态。然后,采用反向选择策略,通过10倍交叉验证的评估结果逐步缩小OTU列表,在此优化过程中同时考虑预测精度和真阴性率。为了控制预测健康个体的错误率(假阳性率),强调TNR的最小化。最终选择了13个基于OTU的标记物,在验证群中高度准确地预测了疾病状态(AUC = 97.6%)。

3. 模型的验证

为了进一步评估这些标记物是否可以推广到其他样本,使用验证群作独立检验,发现其相当高的预测能力(AUC=76.4%)。为了便于诊断应用,进一步构建了临床指标“患者鉴别指数”(基于OTU标记的logistic回归系数加权评分)。PDI的预测能力几乎与更复杂的SVM模型一样高,在发现队列中AUC = 92.4%,在验证队列中AUC = 67.7%。PDIs在健康个体和患者中的分布也显示出清晰的多样化格局,表明其在区分肺癌与健康个体上的有效性。

扩增子测序-案例1

参考文献

Zheng Yajuan,Fang Zhaoyuan,Xue Yun et al. Specific gut microbiome signature predicts the early-stage lung cancer[J] .Gut Microbes, 2020, 11: 1030-1042

案例 2

沿海沉积物古菌群落时空动态:群落构建过程和共现关系

期刊:The ISME Journal 影响因子:9.18 发表时间:2020年3月

研究背景

对海洋底栖古菌群落的研究正在更新我们对其分类学组成和代谢多样性的看法。但在其群落构建过程以及类群间联系等方面仍存在巨大的知识空白。本研究使用16S rRNA基因测序和qPCR技术,研究了冬、夏两季从约1500 km的中国东部边缘海收集的58个表层沉积物样品中古菌群落的时空动态,群落构建过程和共现关系。

样品来源

从中国东部边缘海收集样品,采样区域包括渤海(BS),北黄海(NYS),南黄海(SYS),ECS和CE。总共收集了58个表层沉积物样本(0–2 cm深),38个站点(称为夏季样本),20个站点(称为冬季样本)。

方案设计

样本采集;测定地层水盐度、温度和溶解氧以及无机溶解态营养盐;分析沉积物的理化性;总DNA提取、古菌16S rRNA 基因片段PCR扩增、测序;qPCR测定各样品中总古菌的丰度;数据分析(多样性分析、距离-衰减关系、网络分析等)。

主要结果

1.古菌丰度、多样性和群落组成

古菌16S rRNA基因丰度在采样区域间无显著差异,但季节差异明显,表现为冬季丰度高于夏季(图1a)。除CE外,各采样区域间的alpha多样性无显著差异,CE样品的PD指数与Chao1指数均显著低于其他区域样品(图1b, d)。

2. 古菌群落的地理格局

不同采样点的群落之间存在明显差异,所有样本都分为BS和NYS,SYS,ECS,以及CE四个地理集群(图2c),且SYS区域内部变化比BS和NYS之间更大。相比之下,不同季节之间古菌群落未明显分离。而古菌群落在空间上的变化比季节间的变化更大。夏季和冬季均存在距离衰减现象,即在距离相近的样品中古菌构成相似(图2d)。

3. 生态过程驱动群落结构

扩散限制是最重要的过程,占所有样品群落变异的39.2%(图3a),其次是漂移和均匀选择。总的来说,随机性过程对古菌群落变化的解释比例高于确定性过程,夏季古菌群落变化比例略高于冬季古菌群落变化比例(图3b)。

4. 古菌共存网络

相关性网络分析表明,夏季古菌群落包含334个节点(OTU)和690个边(相关性),在冬季古菌群落由465个节点和1257个边组成。属于同一古菌进化枝的OTU倾向于相互共存(图4a,c)。在夏季和冬季网络中存在八个主要模块,夏季和冬季网络中都具有高度互连的节点(图4b,d)。这些模块中的许多模块由系统发育上接近同一进化枝的OTU组成。

扩增子测序-案例2

参考文献

Liu J, Zhu S, Liu X, Yao P, Ge T, Zhang XH. Spatiotemporal dynamics of the archaeal community in coastal sediments: assembly process and co-occurrence relationship. ISME J. 2020;14(6):1463-1478. doi:10.1038/s41396-020-0621-7

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常见问题
Q1. 16S选择的测序区域各不相同,选择的依据是什么,选择哪个区域比较好?

不同物种不同区域多样性不同,选择不同区域测序结果会有不同,可能会造成物种多样性的低估或高估。在非全长16S测序的情况下,测序区域也并非越长越好,跟全长16S结果最相近的测序区域即是最优选择。一般推荐V4区,一致性较好,根据项目经验,或文献。

Q2.样本检测合格,建库失败了,可能原因?

这种情况常见于宿主微生物样本,该样本通常含有大量的宿主DNA,由于样本检测中不能区分宿主和微生物DNA,实际检测到的DNA其实绝大多数都是宿主DNA,导致检测到的样本量很高,却建库失败。

产品介绍

宏基因组研究以环境中所有微生物基因组为研究对象,通过对环境样品中的全基因组DNA进行高通量测序,获得单个样品的饱和数据量,进行微生物群落结构多样性,微生物群体基因组成及功能,特定环境相关的代谢通路等分析,从而进一步发掘和研究具有应用价值的基因及环境中微生物群落内部、微生物与环境间的相互关系。构建的环境微生物基因集,可为环境中微生物的研究、开发和利用提供基因资源库。

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案例解析
案例 1

农用杀菌剂增加了温室土壤抗生素抗性基因的丰度

期刊:Environmental Pollution 影响因子:5.714 发表时间:2020年4月

研究背景

温室栽培长期施用杀菌剂导致土壤残留污染,改变土壤微生物群落。目前还不清楚残留杀菌剂是否影响土壤中抗生素抗性基因(ARGs)的多样性和丰度。可移动基因元件(MGEs)被认为是导致抗性基因在细菌间水平转移的重要原因。本研究利用宏基因组测序技术分析温室和山地土壤中杀菌剂的耗散及其对ARGs丰度影响,证实一些杀菌剂可能会通过MGEs介导的水平基因转移而提高温室土壤中ARGs的丰度。

样品来源

温室土壤和山地土壤的微宇宙系统

方案设计

室内构建温室和山地土壤实验环境;分别向土壤中添加杀菌剂(嘧菌酯、多菌灵等)和抗生素(金霉素),以无添加土壤为对照;在0、1、3、7、15、30和60天采集土壤样本;检测土壤样本中的杀菌剂和抗生素浓度;提取土壤DNA,宏基因组测序;数据分析与结果可视化。

主要结果

1.温室土壤比山地土壤中含有更丰富多样的ARGs

共检测出18类ARGs,其中温室土壤检出17类,山地土壤检出13类,温室土壤中ARGs的总丰度显著高于山地土壤。温室土壤中检测出ARGs 共计35-53种,山地土壤为10-21种,温室土壤中ARGs的多样性显著高于山地土壤(图1)。ARGs在两类土壤中的共现情况见图2。

2.多菌灵、嘧菌酯和百菌清的施用可以提高温室土壤中总ARGs的丰度

经过60天的实验室模拟,无论是在温室还是山地土壤中,添加三唑酮没有明显改变ARGs的丰度,但是多菌灵、嘧菌酯和百菌清的使用显著提高了土壤中ARGs的丰度。

3. 温室土壤中ARGs丰度与MGEs(如inti1、R485)的相关关系显著

本研究温室土壤中质粒和整合子的多样性及丰度均明显高于山地土壤,其中intI1在温室土壤中丰度很高,而在山地土壤中却很少。此外,温室土壤中MGEs与多种优势的ARGs存在显著的正相关,而山地土壤中与MGEs相关的ARGs数目非常少(图3)。

4. 进一步验证了ARGs和MGEs,如sul2和R485, sul1和转座酶的共现模式

本研究进一步通过宏基因组组装查找ARGs与MGEs的共存依据,在温室土壤中,共发现25对ARG与MGE位于同一个contigs中的现象,例如sul1与转座酶(图4)。这证明温室土壤中杀菌剂残留所带来的选择性压力可能会导致ARGs通过MGEs介导的HGT进行传播和增殖。

5. 温室土壤中ARGs主要由肠杆菌携带,山地土壤中则以放线菌为主

温室土壤中,共鉴定到26个潜在的ARGs宿主细菌属,其中Acinetobacter检出频率最高。在山地土壤中,共鉴定到21个ARGs的潜在宿主,其中最主要的宿主是Nocardia和Streptomyces,与温室土壤一样,vanR基因同样是山地土壤中宿主范围最广的ARG(图5)。

宏基因组测序-案例1

参考文献

Zhang HP , Chen SY , Zhang QK , Long ZN , Yu YL, Fang H. Fungicides enhanced the abundance of antibiotic resistance genes in greenhouse soil. Environmental Pollution. 2020. doi.10.1016/j.envpol.2019.113877

案例 2

宏基因组测序鉴定HPV16感染者阴道微生物组的变化

期刊:Frontiers in Cellular and Infection Microbiolog 影响因子:4.12 发表时间:2020年6月

研究背景

微生物群失衡与癌症发展的关系是目前研究的热点之一。长期感染人乳头瘤病毒(HPV)会引发宫颈癌,但目前对HPV感染中的微生物组组成和功能知之甚少。本实验使用宏基因组测序技术鉴定了HPV16阳性组和HPV阴性组的阴道样本的成分和功能变化,发现HPV16阳性组阴道微生物群的组成和功能发生了改变,表明阴道生态失调可能与女性生殖道HPV感染有关。

样品来源

在2017.2-2018.11期间使用HPV检测和细胞学进行宫颈癌筛查后进行阴道镜检查的2251名未怀孕育龄妇女

方案设计

筛选符合要求的女性作为实验对象;从阴道穹窿和宫颈附近取4个无菌拭子样本进行实验分析;样本分为HPV16阳性组和对照组(HPV阴性和细胞学正常的女性);分别对样本中的微生物进行DNA提取与测序;数据分析与结果可视化;用定量PCR检测微生物标记并作出评价。详细实验流程见图1。

主要结果

1.HPV16阳性妇女阴道菌群的分类变化

尽管HPV16阳性组与对照组均以乳酸杆菌属、加德纳菌属占绝对数量优势(图1)。但进一步研究发现HPV16阳性组厚壁菌门(图2A)、及属于厚壁菌门的乳酸杆菌属丰度显著降低(图2B)。相反,阳性组放线菌门以及属于放线菌门的加德纳菌属的丰度显著增加(图2B)。

2. HPV16感染生物标记物分析

共44种生物标记物在HPV16阳性组样本中富集,仅1种生物标记物在对照组富集(图3)。本研究使用了三种类型的生物标记(12个基因,17个属和7个物种)构建随机森林集成学习法区分HPV16阳性组和对照组,结果显示该方法对HPV16阳性具有较高的预测能力(图4)。

3.与HPV16感染相关的阴道微生物基因

通过Metastats分析,确定了参与88个通路的378个KEGG同源序列 (KOs),在HPV16阳性组和对照组之间差异显著。将在同一途径上序列和功能高度相似的蛋白进行分组,共鉴定出 22 个 KOs,且在HPV16阳性和对照组阴道菌群中的丰度差异显著(图5B)。进一步分析发现,HPV16 阳性组在代谢和膜运输中富集,而在多糖生物合成和代谢、复制和修复中耗尽(图5C)。

4. 评价HPV16感染的生物标记物

随机选择两个16阳性的富集基因标记进行定量PCR检测,结果与宏基因组测序结果具有很强的相关性,证实了方法的可靠性。

宏基因组测序-案例2

参考文献

Yang Q, Wang YP, Wei XY, Zhu JW, Wang XY, Xie X, Lu WG. The Alterations of Vaginal Microbiome in HPV16 Infection as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing. Frontiers.. 2020. doi: 10.3389/fcimb.2020.00286

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常见问题
Q1. 如果存在较大的宿主的污染,且没有宿主基因组的参考序列可以进行宏基因组测序吗?

不可以,如果宿主的基因组序列在环境DNA中的量比较多,测序之后,我们没有办法通过已知的宿主基因组的序列来去污染,会对最后的分析结果造成很大影响,而且可用的数据量会很少;但是如果在提取的过程,宿主基因组的污染的量很少,后期的数据分析还是可用的,但是会存在一定的风险。

Q5. 宏基因组研究推荐多少样本量?

宏基因组样本量需求跟研究目的直接相关。如果侧重于功能挖掘,一个或几个样本即可;如果侧重于组间差异分析,如疾病相关的肠道菌群研究,一般需要较大的样本量,一般每组样本在50个左右,可参考对应的经典研究案例。

产品介绍

宏转录组测序技术(Metatranscriptomic sequencing)通过对特定时期、特定环境样品中所有微生物群落的转录本进行大规模高通量测序,可以直接获得环境中可培养和不可培养的微生物转录组信息。这种技术不仅具有宏基因组技术的全部优点,可以检测环境中的活性微生物、活性转录本以及活性功能进行研究,还可以比较不同环境下的差异表达基因和差异功能途径,揭示微生物在不同环境压力下的适应机制,探索环境与微生物之间的互作机理。

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案例解析
案例 1

青藏高原益生菌通过缓解肠道菌群的氧化应激减轻小鼠铬酸盐的毒性

期刊:Communications Biology 影响因子:4.165 发表时间:2020年5月

研究背景

食物中的重金属(HM)污染危害了人类的健康。最近一项研究表明肠道微生物基因组中出现重金属解毒基因,HM改变肠道微生物的组成和抗氧化功能,但其排毒机制尚未完全阐明。铬是一种常见的重金属污染。本文通过16S rRNA基因和宏转录组测序探究从青藏高原酸奶中分离出的乳酸双球菌菌株BT36对小鼠铬中毒的影响。

样品来源

48只小鼠的肝、肾和小肠组织样本,1、3、5、6、20、30天的粪便样本

方案设计

对六组小鼠的饮食分别进行以下处理,脱脂牛奶、含BT36脱脂牛奶、含XS40脱脂牛奶、Chow-Cr、Normal chow、Diet change,喂养三十天。在1、3、5、6、20、30天取粪便样本,通过16S rRNA基因和宏转录组测序分析。喂养结束后,取肝、肾和小肠组织进行检测分析。

主要结果

1.BT36减少组织中CrD 积累,减少Cr诱导的组织损伤

BT36略微减弱了Cr(VI)诱导的小鼠体重变化,且在六组小鼠的食用量上没有观察到显著差异,说明生长速率的差异是由于Cr(VI)处理所致,而不是由于摄食所致。此外,Cr的摄入增加了组织和粪便中Cr的水平,补充BT36而不是XS40,有效地减少了Cr的积累,促进了其排泄。通过测定MDA、CAT和GSH-px水平,分析组织的氧化效应,结果表明,BT36在缓解cr诱导的肝氧化应激方面比XS40更有效。

2.BT36调节了Cr诱导小鼠肠道紊乱

16S rRNA基因测序结果表明,BT36逆转了Cr诱导的小鼠肠道微生物组成,聚类分析表明在BT36组的肠道微生物结果更接近于对照组,说明BT36缓解了Cr毒性。宏转录组测序进一步分析粪便微生物的活性,在进行BT36干预后,Eubacterium、norank_f_Lachnospiraceae、Helicobacter、Parabacteroids、Clostridium丰度全部或部分恢复,这些结果都证明BT36对肠道有恢复作用。

3. T36上调了与Cr修复有关的GM的DEGs

BT36恢复了788个基因的表达,其中包括34个固有的Cr修复相关基因。通过对10个BT36调控的未注释基因的功能分析,提示在肠道菌群中存在一种新的Cr还原基因。综上,BT36可以调节肠道菌群对Cr诱导的氧化应激的反应,并保护其免受Cr毒性。

宏转录组测序-案例1

参考文献

Feng P, Ye Z, Han H, et al. Tibet plateau probiotic mitigates chromate toxicity in mice by alleviating oxidative stress in gut microbiota. Commun Biol. 2020;3(1):242. Published 2020 May 15. doi:10.1038/s42003-020-0968-3

案例 2

基因组和转录组学研究红树林沉积物中新型产甲烷菌产甲烷潜力

期刊:Microbiome 影响因子:11.607 发表时间:2020年6月

研究背景

产甲烷菌对全球甲烷平衡和碳循环至关重要。产甲烷菌的广古菌门目前分为一个纲和七个目,包括两个新的产烷菌类群,Methanofastidiosa和Methanomassiliicoccales,但对新产甲烷菌产甲烷了解较少。红树林是海岸湿地的重要组成部分,它们可将大气中二氧化碳以有机物形式储存起来,即“蓝色碳”。然而,红树林中不同产甲烷菌的代谢活性及其对甲烷生产的相关贡献仍不清楚。

样品来源

深圳福田自然保护区红树林0 - 2、6 - 8、12 - 14、20 - 22、28 - 30 cm层的沉积物作为样本

方案设计

利用宏基因组学和宏转录组学分析深圳福田自然保护区红树林沉积物样本。通过组装获得微生物基因组,注释并进行功能基因分析。

主要结果

1.基因组重建

对宏基因组测序数据进行从从头组装和分箱,重建了13个产甲烷广古菌的MAGs。其中12个MAG的完整度从69.8%到99.4%不等,只有一个MAG的完整度仅为50.3%。

2. 红树林沉积物中产烷生物的系统发育和相对丰度

为了鉴定MAG谱系,基于16个核糖体蛋白、McrA蛋白序列和16S rRNA基因的串联序列构建了系统发育树(图1)。各层产甲烷菌中MM数量最多。与MM,MAGs 相比,MMA MAGs的丰度并不高,但根据宏转录组分析,它们是各层中最活跃的类群。MF和MS在所有层中均与其他产甲烷菌共存,但它们的相对丰度和活性相对较低。

3. 红树林沉积物中产甲烷发生的三个主要代谢途径的相对重要性

定量PCR分析显示,在五个采样的沉积物层中产甲烷菌的丰度存在显著差异。MAG注释揭示了甲烷生成的多种代谢潜力。确定了三个完整的代谢途径(氢营养型,乙酰碎裂和甲基营养型甲烷生成)(图2)。为了评估在垂直红树林沉积物剖面中甲烷生成的三种代谢途径的相对重要性,对相关基因的相对丰度和表达进行了评估。功能分析表明,自养氢营养甲烷化相关的基因的相对丰度高于各层的异养乙酸甲烷化或甲基营养甲烷化途径。此外,参与氢营养和甲烷营养甲烷生成的基因被高度表达(图3)。

宏转录组测序-案例2

参考文献

Zhang CJ, Pan J, Liu Y, Duan CH, Li M. Genomic and transcriptomic insights into methanogenesis potential of novel methanogens from mangrove sediments. Microbiome. 2020;8(1):94. Published 2020 Jun 17. doi:10.1186/s40168-020-00876-z

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常见问题
Q1.对于小型动物,如果采样时不能分离肠道和肠道内容物,宿主对宏转录组的影响很大,这种情况下,如何解决?

可从以下两方面进行解决:1.在实验建库过程中去除宿主污染(比如用polyA去除宿主MRNA);2.加大测序数据量,通过与宿主基因组比对去除宿主污染,但前提是需要有宿主参考基因组,如果没有宿主参考基因组,当污染很高的情况下,基本上没有办法去除宿主污染。

Q2.宏转录组测序完成后是否需要验证?是用qPCR方法验证吗?

如果是群落水平的验证,qPCR可以作为一个考虑的方法。但是宏转录组的微生物含量非常不稳定,qPCR不一定具有代表性。最好的办法是找到基因的菌落归属,然后做一些单细菌克隆验证。

产品介绍

全基因组重测序(WGS)是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序,并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。它可以获取最全的基因组信息,找到大量的单核苷酸多态性位点(SNP),插入缺失位点(InDel)、杂合性缺失(LOH)、拷贝数变异(CNV)以及基因组重排导致的结构变异位点(SV)。配合比较基因组学分析、群体遗传学分析、进化分析和计算生物学分析方法既可以用于深入探索疾病基因组的奥秘,也可以高效识别动植物的性状连锁区域,为遗传育种提供科学依据和技术支撑。

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案例解析
案例 1

基因组测序分析确定EB病毒亚型与高发病鼻咽癌的关系

期刊:Nature Genetics 影响因子:27.603 发表时间:2019年6月

研究背景

鼻咽癌(NPC)是一种具有独特地理分布的恶性肿瘤,在全球大多数地方很少见,但在中国华南、东南亚、地中海和格陵兰岛等局部区域高发。其中,广东地区鼻咽癌的发病率位居首位,每年10万人中有20-40人被诊断为鼻咽癌,是其它低发病率地区近20倍。EBV是一种与NPC、胃癌、淋巴瘤有关的人类病毒,对自发性淋巴母细胞系和EBV相关疾病的EBV基因组测序表明,不同地理起源的EBV分离株之间存在重要的基因组变异。因此,研究者希望通过EBV全基因组测序(WGS)寻找我国南方NPC高风险EBV亚型,为确定NPC高危人群提供依据。

样品来源

来自诊断为EBV相关癌症患者体内分离的215株EBV,来自中国NPC流行区和非流行区健康对照体内分离的54株EBV

方案设计

利用全基因组测序(WGS)分析269例来自鼻咽癌高发区和低发区的鼻咽癌患者及健康对照中的EB病毒全基因组信息,对比鼻咽癌和健康人来源的EB病毒全基因组信息。

主要结果

1.EBV全基因组测序和 Fine-mapping确定与NPC相关的EBV突变

研究者对269株EBV分离株进行全基因组测序,PCA分析结果表明,EBV沿PC1的分布是连续的(从非洲、欧洲到亚洲),沿PC2的分布表现出部分分离的模式(亚洲NPC流行区、NPC非流行区)。从基因型看,BALF2的突变SNP162215、SNP162476、SNP163364为高风险基因型。

2. 探索三种SNP与NPC的关系

对156例SNP和47例对照进行全基因组关联分析,发现SNPs 162507C>T, 162852G>T 和 162215C>A 在NPC患者全基因组中呈显著差异。进一步验证三个SNP与NPC的相关性,发现与162476T> C和163364C> T相比,SNP162215_C不太可能是与NPC相关的突变位点。

全基因组-案例1

参考文献

Xu Miao,Yao Youyuan,Chen Hui et al. Genome sequencing analysis identifies Epstein-Barr virus subtypes associated with high risk of nasopharyngeal carcinoma.[J] .Nat. Genet., 2019, 51: 1131-1136

案例 2

阿拉伯联合酋长国混合人口的四个代表的全基因组测序

期刊:Frontiers in Gentics 影响因子:3.258 发表时间:2020年7月

研究背景

阿拉伯地区有着独特的人口结构和种族多样性,但是关于人口层面相关的深入遗传研究很少。使用全基因组关联分析来研究人群的遗传结构,可提供有关基因组原型的深入知识。本研究是1000个阿拉伯基因组计划的一部分,对四名阿联酋国民的全基因组进行基因组变异分析。这四名阿联酋国民代表不同的亚人口存在,并构成历史种族混合阿联酋人口。

样品来源

来自四名阿联酋国民的唾液样本

方案设计

利用全基因组测序(WGS)分析4名受试者的唾液样本,进行全基因组测序读数比对,SNP和Indels注释,SV识别,估计4个WGS单倍群的父系和母系的祖先,并估算了4个样品的遗传祖先,此外对4个样本的基因组之间的距离以及来自HGDP世界人口的基因组之间的距离进行了系统发育定位,变种的验证,从基因分型数据对本地等位基因频率进行注释。

主要结果

1.四个阿联酋样本概述

根据混合程度和亚群中心性,选择四个WGS中阿联酋不同亚群代表的样本。从PCA图中可以看出这四个样本在HGDP(人类基因多样性工程)中的情况(图1)。

2.四个样本的变异分析

这四个样本平均每个样本具有4,427,749个确定的变异体。在这些变异中,平均80%为SNP,20%为InDel。杂合子和纯合子变异的比例分别为65.4-57.4%和42.6-34.6%。进一步确定三个男性个体分别属于Y-单倍型群:J1(UAE S011),E1(UAE S012)和J2(UAE S014)。此外,UAE S011和UAE S014拥有相同的H2mtDNA。

3. 进化树分析及SV分析

使用包含四个主体的邻接方法重建系统发育树(图2),发现UAE S011和UAE S014样本属于中东的阿拉伯人群组,UAE S012也归入中东群组,但与撒哈拉以南非洲集团更接近,而UAE S013处于中/南亚群组的中心位置。此外,SV总数为15677至20339,只有约13.5%是新发现的。

4. 与特定疾病相关的变异

通过将具有潜在易感性的变异与疾病列表关联分析,本研究描绘出个人基因组的基因型与疾病之间的关联。图3显示了四个样本中共有或特有的,且被认为是可致病(红色)或被评估为危险因素(蓝色)的变异,例如,共有变异可致的疾病包括心脏传导缺陷等。

全基因组-案例2

参考文献

Daw Elbait G, Henschel A, Tay GK, Al Safar HS. Whole Genome Sequencing of Four Representatives From the Admixed Population of the United Arab Emirates. Front Genet. 2020;11:681

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全基因组-送样建议

常见问题
Q1.全基因组测序的数据量推荐?

每个样本推荐的数据量与样本类型和要做的信息分析内容相关。例如关注个体样本的SNP,对SNP的准确度和覆盖度要求比较高,一般推荐测序深度>30X,对于稀有变异测序深度还要进一步提高;用于研究群体结构的样本,测序深度推荐10X以上;纯合样本混样检测等位基因频率,推荐平均每个样本的测序深度在1X以上,混合样本测序深度不低于30X;DH和RIL群体构建Bin Map,子代群体测序深度可以测序1X/样本。

Q2.样本量选择多大合适?

样本量大小与样本类型和研究目的相关。例如进行群体进化研究推荐30个样本以上,因为从统计学上说30个以上才属于大样本;对于进行基因挖掘的项目来说,无论是利用自然群体进行GWAS分析或是用家系群体进行连锁分析,都是群体越大越好,一般的情况下进行GWAS分析的样本推荐300个样本以上,对于家系群体推荐200个以上。

全基因组关联分析
产品介绍

全基因组关联分析(Genome wide association study,GWAS)是对多个个体或群体在全基因组范围的遗传变异(标记)多态性进行检测,进而将获得的基因型与表型,进行群体水平的统计学分析,根据统计量或显著性 p 值筛选出最有可能影响该性状的遗传变异(标记),挖掘与性状变异相关的基因。

随着基因组测序技术的快速发展及其测序成本的显著下降,全基因组关联分析已广泛应用于人类疾病和动、植物重要经济性状研究。

全基因组关联分析

图片引自:Jones, Samuel E et al. “Genome-Wide Association Analyses in 128,266 Individuals Identifies New Morningness and Sleep Duration Loci.” PLoS genetics vol. 12,8 e1006125. 5 Aug. 2016, doi:10.1371/journal.pgen.1006125

产品介绍

转录组测序,对某一物种或特定细胞在某一功能状态下产生的总RNA进行高通量测序,但现阶段该技术主要检测mRNA。转录组测序既可以检测基因表达水平差异,又可以提供结构分析,发现未知转录本和稀有转录本,精确地识别差异可变剪切位点、基因融合、SNP以及InDel突变等。现该测序技术无需预先针对已知序列设计探针,即可对任意物种的整体转录活动进行检测,提供更精确的数字化信号、更高的检测通量以及更广泛的检测范围,是目前深入研究转录组的强大工具。目前转录组测序已广泛应用于动植物经济性状, 遗传改良,生长发育调控机制,人类重大疾病发病机制等研究。

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实验流程

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分析内容

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案例解析
案例 1

代谢组和转录组测序揭示山茶粉色花朵花青素代谢

期刊:Molecules 影响因子:4.1 发表时间:2019年3月

研究背景

几乎所有茶树的花朵(茶花)都是白色的,这导致研究人员几乎不关注茶花中花青素(anthocyanin)的积累和颜色变化。广东白塘山发 现了一个新的紫芽品种即白塘紫茶(BTP),它的花朵呈天然粉色,这为了解茶花花青素代谢网络和花色形成提供了机会

样品来源

在同一天收集白塘紫茶生长发育五个阶段的花卉样品,这五个发育阶段为:花蕾阶段(BTP1),花瓣开始分裂阶段(BTP2),半开花阶 段(BTP3),盛开阶段(BTP4)和枯萎阶段(BTP5)。每个阶段包含来自不同茶树的三个生物学重复样本,共计15个样本。

方案设计

对来自五个阶段的花卉样品进行转录组测序和非靶向代谢组(UPLC-ESI-MS/MS系统)的定性定量,后进行转录组和非靶向代谢分析。

主要结果

1.茶花在五个生长阶段代谢产物的变化

在同一天收集白塘紫茶生长发育五个阶段的花卉样品,这五个发育阶段为:花蕾阶段(BTP1),花瓣开始分裂阶段(BTP2),半开花阶 段(BTP3),盛开阶段(BTP4)和枯萎阶段(BTP5)。每个阶段包含来自不同茶树的三个生物学重复样本,共计15个样本。

2.紫色茶花五个阶段的差异基因分析

采用KEGG功能富集分析共鉴定到了21个与花青素通路相关的差异表达基因(DEG)。使用维恩分析和KEGG功能富集分析筛选了在花 朵发育五个阶段中的10个DEGs(图2)。通过比较组间花卉发育阶段的DEG及其表达水平,发现BTP中花青素的生物合成和积累主要发生在 BTP3至BTP4之间(图3)。尤其是在花青素合成高峰期,分别有17、4个结构基因上调或下调。

3.WGCNA基因共表达分析和关键基因筛选

使用加权基因共表达网络(WGCNA)对8个关键基因分析,发现这些基因直接影响三种类黄酮化合物的生物合成和积累,分别是矢车菊素-3-O-半乳糖苷、矮牵牛苷3-O-葡萄糖苷、表儿茶素没食子酸酯。这些结果为研究富含花青素茶叶比如紫芽茶树花的着色分子机制提供了线索。

转录组_案例1

参考文献

Rothenberg D , Yang H , Chen M , et al. Metabolome and Transcriptome Sequencing Analysis Reveals Anthocyanin Metabolism in Pink Flowers of Anthocyanin-Rich Tea (Camellia sinensis)[J]. Molecules, 2019, 24(6):1064.doi: 10.3390/molecules24061064

案例 2
研究背景

热应激(Heat Stress, HS)对鸡的生长性能有负面影响。随着农业扩张,鸡养殖或将分布在气候炎热地区,商业养殖鸡虽能快速生长却表现脆弱。而那些世代生长在高温环境中的土鸡可能具有更强的耐热性。本研究旨在探索能适应两种不同农业气候环境鸡的HS响应机理。

样品来源

来自肯亚高纬度和低纬度地区土鸡的心肌和骨骼肌,共计64个样本

方案设计

本研究对来自湿热低地和较冷高地地区的32只生态型本地土鸡RNA测序,研究短期(5 h / 35°C)和长期(3 天 / 35°C)热应激对心肌和骨骼肌的影响。来自低地和高地的土鸡分别16只,每组作急性/对照组和慢性/对照组处理(图1),ALL(短期/低地),AHL(短期/高低);CLL(长期/低地)和CHL(长期/高地)共计4组。

主要结果

1.热应激对低地/高地土鸡基因表达的影响

对不同条件下两类土鸡的所有基因表达量进行PCA分析(图2),结果显示表达量差异大部分来自土鸡品种,小部分来自于热应激效应。

2.对骨骼肌/心肌差异基因分析

实验发现短期组直肠温度升高度数和差异表达基因(DEGs)个数比长期组高两倍,这表明周期性的HS可以诱发实验鸡对环境的适应性。此外,短/长期热应激组具有组织差异和阶段特异性差异,具体表现为在长期组心脏和骨骼肌差异基因分别富集到过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号和丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路,在短期组的心脏和骨骼肌均富集到p53信号通路(图3)。

3.共表达网络分析

实验使用特异性共表达网络(GCN)整合急性和慢性DEGs,鉴定出与低/高地组高度关联的中心基因。GCN基因通路分析指出p53和PPAR信号通路同时存在高/低地调控网络,内质网中MAPK信号传导和蛋白质加工仅在高地组富集。这表明,为了消散积聚热量,减少热量诱导的细胞凋亡并促进DNA损伤修复,这些本地鸡激活或抑制了不同的基因,同时表明了不同生态型鸡的热耐受性和HS响应机制存在差异。

转录组_案例2

参考文献

Srikanth K, Kumar H, Park W, et al. Cardiac and Skeletal Muscle Transcriptome Response to Heat Stress in Kenyan Chicken Ecotypes Adapted to Low and High Altitudes Reveal Differences in Thermal Tolerance and Stress Response. Front Genet. 2020;11:197. doi:10.3389/fgene.2019.00993

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常见问题
Q1. 与基因芯片相比,转录组测序有什么优势?

转录组测序优势:1.基因芯片利用已知序列探针和样本mRNA杂交获得mRNA序列信息,只能探测已知mRNA,而转录组测序不仅可以检测已知mRNA还能检测新mRNA。2.转录组测序在基因表达定量上更为灵敏,还能进行可变剪切,SNP/InDel变异分析。

Q2. RNA-Seq一般需要几个重复样本?

设置生物学重复可以在很大程度上消除样本的个体差异、系统平台差异,能更准确地检测差异基因。转录组测序实验中建议设置3-4个生物学重复,当结果结果不一致时,可以排除差异较大的个体。

Q3. RNA-Seq测序数据量与基因组大小有关吗?

RNA-seq测序数据量与物种转录本数量有关,一般物种即使基因组大小相差很大,但其编码基因数量相差不大,在3万左右。因此对于检测基因表达量,建议数据量10-25 M reads;对于可变剪接,推荐数据量50-100 M reads;对于denovo拼接,建议> 100 M reads。测序长度推荐PE150。

Q4. 有参转录组测序分析中,与参考基因组的序列比对率多高才能够满足后续分析?

与参考基因组的比对率与多个因素有关,包括基因组组装质量、测序质量、有无污染等;一般来说,与参考基因组的比对效率在70 %以上时,该基因组可以满足后续的分析需求。当比对效率低于60 %时,需要考虑换参考基因组或者按照无参转录组分析策略进行分析。

Q5. 转录组测序筛选的差异基因如何进行后续实验验证?一般验证多少个差异基因合适?

推荐使用最常见的实时荧光定PCR(qRT-PCR)实验验证转录组测序结果。一般验证15-20个差异基因比较合适,除此之外还有原位荧光杂交(FISH)、Northern blot、基因敲除、敲低、转基因等。

产品介绍

全转录组是指特定物种、组织或细胞在特定状态下所有转录产物集合,包括mRNA和非编码RNA。目前全转录组测序主要检测了mRNA,lncRNA、circRNA和miRNA。通过联合分析,可以解析RNA间相互作用及共表达调控网络,并且进行竞争性内源RNA(ceRNA)分析,从而更加全面解析特定的生物学过程。

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案例解析
案例 1

预测骨肉瘤化疗耐药相关的内源竞争RNA网络

期刊:Molecular Therapy 影响因子:8.986 发表时间:2019年3月

研究背景

化疗耐药是骨肉瘤(OS)治疗中遇到的一个巨大障碍。蛋白质编码的mRNA,以及非编码RNA(ncRNA),包括长ncRNA(lncRNA)、环状RNA(circRNA)和microRNA(miRNA),已被证明在癌症生物学调控中起着重要作用。但是,竞争内源RNA(ceRNA)调控的mRNAs与ncRNAs在OS化疗耐药中的关系尚不清楚。

样品来源

三株人OS细胞系(MG63、KHOS、U2OS)以及来自80例原发性OS患者的组织样本

方案设计

实验设置三对配对的多药化学抵抗和化学敏感骨肉瘤细胞系实验组,并对其进行全转录测序,其结果用于预测ceRNA网络。使用qRT-PCR,RNA验证免疫沉淀(RIP)、RNA pull-down分析和双重荧光素酶报告基因检测对ceRNA调控网络进行验证

主要结果

1.lncRNAs、circRNA、miRNAs及 mRNAs表达谱比较

对化疗耐药组和化疗敏感组的lncRNAs、circRNAs、 miRNAs、 mRNAs分别进行差异分析,分别发现339、80、21、2606个差异表达RNA。其中上、下调幅度最大的lncRNA分为lnc-DNMT1-2:1和lnc-RPLP0-4:1。此外,circRNA、miRNA和mRNA上调最多的是 hsa_circ_0004674,hsa-miR-337-3p和C6orf106,而下调最多分别为hsa_-circ_0068458,hsa-miR-203a-3p及AKR1C2(表1)。

2.lncRNAs、circRNA、miRNAs及 mRNAs参与的KEGG/GO通路

GO富集分析表明lncRNA-miRNA网络主要与膜内骨化、胶原型XIV三聚体和角蛋白丝结合通路有关。此外,差异mRNAs富集的KEGG 通路中有20条参与lncRNA-miRNA网络。化学致癌,调节肌动蛋白细胞骨架和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-Akt信通路富集基因数量最多。

3.lncRNA-miRNA-mRNA和circRNA-miRNA-mRNA调控网络

本研究利用11个基本富集在所有通路中的差异mRNAs构建了1,269个lncRNA-miRNA-mRNA途径(图1A)和90个circRNA-miR- NA-mRNA途径(图1B)。其中有3个circRNAs和11个lncRNAs共享相同miRNA/mRNA,8个circRNAs和132个lncRNAs共享相同mRNA,而不是相同miRNA。

4.随机筛选两条通路的验证

结合q PCR,RIP、RNApull-down实验,结果显示hsa-miR-200b-3p靶向lncRNA:MEG3,并与其3’UTR分子结合。 miR-200b-3p可以靶向具有互补结合位点的AKT22 mRNA 3’UTR(图2P)。荧光素酶报告基因分析也验证了miR-200b-3p和AKT2之间的分子相互作用(图2Q)。此外,hsa_circ_0001258与has-miR-744-3p有8个结合位点(图2L),而hsa-miR-744-3p可以靶向GSTM2 mRNA的 3’UTR。荧光素酶报告基因分析表明hsa_circ_0001258可与hsa-miR-744-3p结合,hsa-miR-744-3p可与AKT2 mRNA的3’ UTR结合。上述结果确定了lncRNA MEG3/hsamiR-200b-3p/AKT2h和hsa_circ_0001258 / hsa-miR-744-3p/GSTM2通路OS化疗耐药中的作用。

全转录组_案例1

参考文献

Zhu, K. P., Zhang, C. L., Ma, X. L., Hu, J. P., Cai, T., & Zhang, L. (2019). Analyzing the interactions of mRNAs and ncRNAs to predict competing endogenous RNA networks in osteosarcoma chemo-resistance. Molecular Therapy, 27(3), 518-530. doi: 10.1016/j.ymthe.2019.01.001

案例 2

玉米赤霉烯酮影响猪卵巢颗粒细胞毒理学分子机制

期刊:Environmental Pollution 影响因子:6.792 发表时间:2020年1月

研究背景

玉米赤霉烯酮(ZEA)是一种存在于动物饲料中类似于雌激素的霉菌毒素,具有很强的生殖毒性。卵巢颗粒细胞(GCs)在猪卵泡发育成熟过程中起着至关重要的作用,然而,玉米赤霉烯酮影响卵巢颗粒细胞发育的内源竞争RNA(ceRNA)网络仍有待进一步研究。本研究首次采用全转录组测序技术来探索ZEA在猪GC上的毒理学分子机制。

样品来源

取母猪卵巢并用生理盐水处理,收集卵泡液并分离卵巢颗粒细胞

方案设计

以原代培养的猪卵巢颗粒细胞为模型,设立玉米赤霉烯酮(ZEA)对照组、高、低剂量组。对三组细胞进行全转录组测序,探究ZEA影响猪卵巢颗粒细胞相关靶基因的内源竞争RNA网络,并将该结果与qRT-PCR,免疫荧光和Western Blotting结果互相验证。

主要结果

1. ZEA对卵巢颗粒细胞的毒性

免疫荧光结果显示随ZEA浓度增加,细胞凋亡率逐渐升高。猪卵巢颗粒细胞的细胞周期被ZEA影响并阻滞在G2/M期。

2. ZEA上调与细胞周期相关的基因表达

ZEA会影响一些与细胞周期停滞相关的基因的表达,包括CDK1,CCNB1,CDC25A和CDC25C,该结论与qRT-PCR,免疫荧光和Western Blotting的结果一致。此外,基因组富集分析(GSEA)显示,与对照组相比,通路HALLMARK_G2M_CHECKPOINT富集在30 mM ZEA治疗组中(图1)。且与G2/M checkpoint有关的基因集在30 mM ZEA治疗组中高度表达。在细胞周期通路中富集的差异mRNAs主要参与7条KEGG通路,如图2所示。

3. ceRNA网络构建

Chord图显示了全基因组分布的差异mRNA/miRNA/lncRNAs(图3A)。有差异mRNA分布的X和3号染色体上(红色)上没有发现差异miRNA/lncRNA。此外,差异mRNA的总数大于差异miRNA/lncRNA的总数,这表明ncRNA在生命活动中起着重要作用。根据 mRNA-miRNA,mRNA-lncRNA和miRNA-lncRNA的靶向关系构建ceRNA网络(图3B),此ceRNA网络进一步证明ncRNA参与编码 RNA的调控,并参与细胞生理活性的调控。

全转录组_案例2

参考文献

Li N, Liu XL, Zhang FL, et al. Whole-transcriptome analysis of the toxic effects of zearalenone exposure on ceRNA networks in porcine granulosa cells. Environ Pollut. 2020;261:114007. doi:10.1016/j.envpol.2020.114007

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全转录组_送样建议

常见问题
Q1. 全转录组测序建几个文库,测多少数据量?

全转录组建立两种文库:1. 小RNA文库,采用切胶富集小RNA片段建库模式,进行SE75测序,得到10-20 M clean reads。2. lncRNA文库,采用去核糖体链特异性建库模式,进行PE150测序模式,数据量10 G。

Q2. 全转录组测序的优势主要有哪些?

全转录测序可同时分析mRNA、LncRNA、circRNA和microRNA,解析RNA间相互作用及共表达调控网络,并且进行竞争性内源RNA(ceRNA)分析

Q3. lncRNA建库测序结果可以分析circRNA吗?

可以,lnc RNA建库模式采用去核糖体链特异性方式建库,并打断RNA测序,相当于获得全部RNA,因此可以将测序结果比对到环状RNA数据库,并统计circRNA表达情况。

产品介绍

单细胞转录组测序单细胞转录组测序(Single cell RNA sequencing)是在单个细胞水平对mRNA进行高通量测序的一项新技术,针对单个细胞研究其整体水平的基因表达情况,成功解决细胞分子机制研究中常见的细胞异质性、细胞量少而无法进行常规高通量测序等难题。传统的测序方法只能得到许多细胞表达的平均值,丢失了细胞间的异质信息。与传统的测序技术相比,单细胞测序技术具有检测细胞之间异质性的优势,并且能够识别数量很少的细胞群。

实验流程

分析内容

案例解析
案例 1
研究背景

肿瘤异质性是肿瘤生物学、治疗反应和患者生存的关键决定因素。然而,传统的分子图谱研究很大程度上依赖于大组织分析,这掩盖了不同细胞群的特征。预定义标记的基础上纯化细胞是表征肿瘤异质性的一种策略,但这种方法由于缺乏对精确的细胞类型和状态的了解而受到限制。而单细胞测序技术能够全面、公正地分析肿瘤肿块内的细胞多样性。

样品来源

11个结直肠癌(CRC)病人的癌组织和相应的正常粘膜组织

实验设计

利用单细胞RNA-seq分析来自11个CRC和匹配的正常粘膜组织样本,对CRC及其微环境的转录异质性进行无偏倚分析。为了更好地聚类单细胞转录组,开发一种可提高聚类精度即参考成分分析(RCA)算法。

实验结果

1. RCA鉴定CRC肿瘤和正常粘膜中的多种细胞类型

通过RCA鉴定了两种不同的癌相关成纤维细胞亚型,产生7个不同的细胞簇,根据已知标记物的表达,将7个簇分别标注为上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、B细胞、T细胞、肥大细胞和髓细胞(图1)。

2. scRNA-seq分析识别肿瘤中差异表达的基因

将这些单细胞差异表达结果与CRC组的大样本肿瘤分析结果进行比较,发现干细胞/TA样细胞和成纤维细胞的折叠变化方向一致(图2)。此外,差异表达基因的单细胞列表中也包含了许多CRC先前功能研究中突出的基因。总之,通过单细胞和大容量分析鉴定的差异表达基因之间的一致性显著但有限。

3. 单细胞转录组特征使CRC划分为患者生存率不同的亚组

在对应的单细胞转录组平均水平之上,构建了六种肿瘤细胞类型的表达标记。在六种标记中分别确定了相同的三个肿瘤组:S1、S2和S3(图3)。这些结果进一步强调了CAFs与CRC结果的潜在相关性,并证明了从单细胞转录组推断的细胞类型特异性标记的预后价值。

参考文献

Li Huipeng, Courtois Elise T, Sengupta Debarka et al. Reference component analysis of single-cell transcriptomes elucidates cellular heterogeneity in human colorectal tumors [J]. Nat. Genet, 2017, 49: 708-718

案例 2
研究背景

心脏是哺乳动物胚胎发育过程中形成的第一个功能器官。心脏发育是一个精细协调和高度复杂的过程,涉及不同细胞谱系的协同作用。虽然心脏发育形态已被彻底研究,但对人类胚胎心脏发育的基因调控知之甚少。单细胞RNA测序(scRNA-seq)为研究胚胎从种植前胚胎发育到器官形成的过程提供了强有力的工具。

样品来源

18个人类胚胎5周到25周的4948个单细胞

实验设计

利用scRNA-seq分析人类胚胎5到25周的4000多个单细胞,将5到7周定义为早期阶段,9到17周为中期,20到25周为后期。通过无监督分析确定人类胎儿心脏的特定细胞类型,研究不同细胞类型的特征。分析心脏发育过程中的关键信号通路,研究在单细胞分辨率下人类和小鼠的转录谱差异。

实验结果

1. 人类胚胎心脏细胞类型的鉴定

系统鉴定了人类胚胎期心脏的主要细胞类型,包括心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、瓣膜细胞、心外膜细胞、平滑肌细胞以及各种免疫细胞(包括肥大细胞、巨噬细胞、T细胞核B细胞),分析了主要marker基因及功能。

2. 主要细胞类型的关键时空发育特征

随着心脏发育进展,心房、心室中的心肌细胞比例显著下降,成纤维细胞、巨噬细胞等非心肌细胞的比例逐渐上升,这说明在发育过程中成纤维细胞等非心肌类型细胞对心脏发育的作用可能越来越重要。

参考文献

Cui Yueli, Zheng Yuxuan, Liu Xixi et al. Single-Cell Transcriptome Analysis Maps the Developmental Track of the Human Heart[J]. Cell Rep, 2019, 26: 1934-1950.e5

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常见问题
Q1. 为什么要做单细胞转录组测序?

传统的测序方法只能得到许多细胞表达的平均值,但细胞之间的表达可能有差异。单细胞转录组测序通过在单个细胞水平上对mRNA进行高通量测序,研究单个细胞的基因表达情况,为研究解析单个细胞的行为、机制、与机体的关系等提供了新方向,广泛应用于生殖细胞、胚胎干细胞、神经细胞、肿瘤细胞、免疫细胞等热点研究领域。

Q2. 制备用于单细胞转录组测序的样品时要注意哪些问题?

首先要确保细胞被完全解离成单细胞,并且是有活性的。对于那些已经处于悬浮状态的细胞只需进行清洗和计数即可,但对于组织类样本,必须先进行解离。单细胞转录组测序的结果与RNA的完整性密切相关,同时,单细胞转录组测序无法观测到所有的基因,因此要确保单细胞内RNA的完整性。分离后立即冰冻或新鲜组织的细胞能够最大程度保存RNA完整性。

Q3. 细胞捕获数与基因检出数和哪些因素相关?

细胞捕获数与样本活性以及细胞浓度密切相关,一般建议5000细胞。基因检出数与样本状态有关,不同类型的样本,基因检出数存在数倍的差异。

产品介绍

Small RNA(包括 miRNAs、siRNAs 和 piRNAs 等)是生命活动重要的调控因子,在基因表达调控、生物个体发育、代谢紊乱及疾病发生和发展等生理过程中发挥重要作用。miRNA 是一类内源性的、长度约 18-25 nt、具有调控功能的非编码RNA,通过和靶基因碱基配对引导沉默复合体降解 mRNA 或阻碍其翻译。Small RNA 测序技术不受物种限制,既能鉴定特定条件下表达的 miRNA,又能预测发现新的 miRNA,对于疾病的发生发展研究有重要意义。

SmallRNA_产品应用

实验流程

SmallRNA_实验流程

分析内容

SmallRNA_分析内容

案例解析
案例 1
研究背景

微小RNA(miRNA)是一类长度19-25个核苷酸的内源性非编码调控RNA,其通过降解mRNAs或抑制mRNAs翻译来参与细胞生物学功能调节,包括细胞发育和分化、代谢、细胞周期和凋亡等及重要炎症调节。急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leuke-mia, ALL)是一种起源于淋巴细胞的B系或T系细胞在骨髓内异常增生的恶性肿瘤性疾病。miRNAs异常表达对于ALL的发病机制与临床应用有至关重要的作用,miRNAs已迅速成为 T-ALL潜在的治疗靶点。然而,目前对T-ALL的miRNA转录研究较少。

样品来源

骨髓样本来自34例儿科T-ALL患者和5位年龄小于18岁的健康骨髓供体。使用密度梯度离心方法分离骨髓样本的单核细胞,后进行免疫磁分离,以获得T-ALL细胞和正常成熟的T淋巴细胞(对照)用于RNA分离。此外,本研究使用GSE89978数据进行联合分析。

方案设计

对34例实验组和5例对照组进行miRNA测序并分析,后联合公共数据分析,其分析流程参照miRge。其差异miRNA结果由RT-qPCR验证,通过验证的miRNAs分析其靶基因和参与的KEGG/GO通络。

主要结果

1. miRNA表达谱分析

对34例T-ALL组与5例对照组分析结果显示有1462个miRNAs表达,其中452个仅在T-ALL实验组中表达(图1)。差异分析共鉴定出61个差异表达miRNAs,其中hsa-miR-128-3p,hsa-miR-181a和hsa-miR-181b已在其它致癌基因研究中报道。联合分析中,实验vs对照组中T淋巴细胞和胸腺细胞中的miRNAs分析显示有103个差异表达miRNAs。在T-ALL或正常成熟T淋巴细胞和胸腺细胞中差异过表达的miRNA,分别代表候选致癌或抑癌miRNA。此外,对34例T-ALL组/5例对照组的miRNA分析结果展示出不同亚型T-ALL呈现不同的miRNA表达谱(图2)。

2. 靶基因预测和通路富集分析

对在T-ALL与对照组差异表达的61个miRNA进行靶向预测,通过筛选,最后定义了225个预测靶标。这个靶向基因在KEGG、GO通路富 集在与T-ALL发病机理相关的生物学通路中,包括白介素6–介导的信号传导,mTOR信号传导和凋亡调控。研究最终专注于hsa-mir-106a-363簇,并在功能上验证了hsa-miR-20b-5p和hsa-miR-363-3p与它们的预测靶标(PTEN,SOS1,LATS2)的3'端非翻译区的直接相互作用,深度参与调节细胞凋亡(图3)。 hsa-mir-106a-363是直接致癌hsa-mir-17-92簇的旁系同源物,在T-ALL的发病机理中尚未确定。本研究为miRNA-mRNA相互作用在T-ALL中的功能分析提供了坚实的基础和数据资源。

SmallRNA案例1

参考文献

Dawidowska M, Jaksik R, Drobna M, et al. Comprehensive Investigation of miRNome Identifies Novel Candidate miRNA-mRNA Interactions Implicat- ed in T-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia. Neoplasia. 2019;21(3):294-310. doi:10.1016/j.neo.2019.01.004

案例 2

鉴定辣椒疫霉感染诱导拟南芥miRNAs的变化

期刊:Frontiers in Microbiology 影响因子:4.235 发表时间:2020年6月

研究背景

Phytophthora capsici是一种土传致病性卵菌,可引起50多种植物的严重枯萎病和果实腐烂,包括辣椒、番茄、黄瓜和其他重要的商业作物。最近的研究表明,辣椒-拟南芥系统是分析卵菌-植物相互作用的模式病理系统。探索宿主-病原菌之间的相互作用是提高我们对致病性的分子基础的理解和制定疾病管理策略以保护食品生产免受辣椒疫霉感染的第一步。内源性sRNAs是植物免疫系统对各种病原体作出反应的一种普遍的调节机制。然而,辣椒疫霉侵染对拟南芥内源性sRNAs的影响尚未见报道。

样品来源

将哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)置于22℃土壤,长日照环境下生长。Col-0对辣椒疫霉LT263高度敏感。用10 μL 椒悬浮液(实验组)或MgCl2(对照组)处理3周龄Col-0植株的叶片背面。在0(对照组)、3、6、12和24 小时收集叶片,液氮冷冻提取RNA。

方案设计

本研究对实验组和对照组进行sRNA测序。为了验证sRNA-seq结果的可靠性,研究使用northern印迹分析和qRT-PCR研究了在4个感染阶段上调的5个sRNA的表达及其潜在的靶基因。

主要结果

1. miRNA序列分析

对miRNA序列的分析表明,长度为21/24 nt的sRNAs在四个感染阶段含量均最高(图1A)。长度为21/24 nt miRNA序列的第一个核苷酸中90%以上是尿嘧啶(图1B),表明植物sRNAs的分布高度一致。在0、3、6、12和24个hpi文库中,分别有86.73、85.15、83.60、73.63和91.55% reads比对到Col-0基因组上(图1C)。此外,鉴定出293个已知miRNAs和6个潜在的新sRNAs(miRNAs或siRNAs),其中33个miRNAs在4个不同感染阶段有差异。

2. miRNA表达谱分析

与对照组相比,分别有23、28、29和30个miRNAs在3、6、12和24 hpi分别上调。此外,有27、23、30和26个miRNAs在这四个感染阶段下调。其中,有19个和14个miRNAs在所有四个感染阶段分别上调和下调,表明约30.9%的新鉴定miRNAs在辣椒疫霉感染期间持续表达。

3. 差异miRNA和其靶基因验证

sRNA-northern杂交结果与sRNA-seq数据基本一致。在辣椒疫霉菌感染后,所有5个上调miRNAs的表达量显著增加到最高水平(图2A)。但与sRNA-seq分析结果不同的是,northern印迹分析显示,在12hpi时,novel_24、miR4228-3p和miR408-5p的累积量大于其他时间点(图2A)。茎环qRT-PCR结果与sRNA-seq和northern杂交结果一致。与对照组相比,在12hpi时,novel_24、miR4228-3p和miR408-5p的转录丰度最高,而miRNA846-5p的转录丰度在3hpi时最高(图2B)。

4. 基因富集分析

GO和KEGG富集分析表明,差异表达miRNAs的潜在靶基因都在淀粉和糖代谢、剪接体和植物-病原菌相互作用等途径中富集,说明剪接机制和致病相关蛋白在辣椒疫霉菌感染反应中起重要作用。

SmallRNAseq案例2

参考文献

ZHU, Xiaoguo, et al. High-throughput sequencing-based identification of Arabidopsis miRNAs induced by Phytophthora capsici infection. Frontiers in microbiology, 2020, 11: 1094. doi: 10.3389/fmicb.2020.01094

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常见问题
Q1. APExBIO可以提取外泌体miRNA吗?

可以。目前可抽提细胞、血浆、血清样品的外泌体miRNA。

Q2. Small RNA测序的样品类型和要求?

样品类型包括总RNA,组织细胞样品,血清血浆样品以及切胶回收的Small RNA样品等。其中总RNA提取不要使用过柱试试剂盒。

Q3. 什么是miRNA种子区(“Seed” Region)?

种子区是成熟 miRNA 5’端第 2-8 位序列,是 mRNA 结合中最关键的序列。

Q4. miRNA 数据库miRNA靶基因预测网站或软件有哪些?

miRNA 数据库包括miRBase、miRDB、PMRD等。目前 miRBase (http://www.mirbase.org/)已升级至 22.0 版本,囊括了 223 个物种的miRNA。 PMRD (http://bioinformatics.cau.edu.cn/PMRD/)是一个专门针对植物 miRNA 的数据库常用miRNA靶基因预测网站或软件有RNAhybrid、miRanda、microRNAorg、TargetScan、 Pictar 等。

产品介绍

环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类特殊的内源非编码RNA,它大量存在于真核细胞胞质内,主要由pre-mRNA在可变剪接的过程中,将上游exon的5’端与下游exon的3’端剪接到一起,形成的首尾相接的环状RNA分子。在功能上,circRNA分子富含microRNA(miRNA)结合位点,充当分子“海绵”( miRNA sponge)的作用,进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用,升高靶基因的表达水平;在细胞生长发育,功能代谢和某些病理反应中发挥重要的调控作用。例如,circRNA可以作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)结合胞内miRNA,通过circRNA-miRNA-mRNA的途径来阻断miRNA对其靶基因的抑制作用。除此以外,circRNA也具有调控其他类型RNA、调节蛋白质活性等功能。

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案例解析
案例 1

非线性RNA表达研究老年痴呆症临床和神经病理相关

期刊:Nature Neuroscience 影响因子:20.071 发表时间:2019年11月

研究背景

circRNA在神经系统中高度表达,且在突触中富集。在大脑中,circRNA的表达可以独立于其线性转录表达,并且可能是一个基因中表达量最高的亚型。脑内circRNA在发育和对神经元兴奋的反应中也受到一定程度的调控。先前对阿兹海默症(AD)的研究主要集中于探究线性转录本(主要是mRNA)的差异表达,以此揭示该疾病的发病机制和潜在的治疗目标。本研究将关注AD疾病的环形转录本的表达差异,进而获取对AD有效的治疗策略。

样品来源

共计96例Dicovery数据库中的AD和对照样本,以及来自MSBB数据库的195例样本

方案设计

对来自Discovery数据库实验组(83例)和对照组(13例)样本和来自MSBB数据库样本联合进行circRNA的生物学信息分析

主要结果

1. circRNA差异表达分析

使用DESeq2软件对AD病例及对照组进行circRNA差异表达分析,并与临床AD定量指征—Braak评分和临床痴呆评分进行相关性分析。结果显示,在discovery数据库中共鉴定出37个与至少一个AD性状显著相关的circRNA,而在MSBB数据库中分析发现164个与至少一个AD 性状显著相关的circRNA,且两者结果高度一致。表明circRNA的表达与AD的诊断、临床痴呆的严重程度和神经病理学的严重程度之间存在显著的相关性(图1)。

2. circRNA的表达是否在AD实质性症状出现前发生变化,以及这些变化是否局限于随机发生的AD

实验将circRNA分析扩展到症状出现前的AD样本(已有神经病理学证实,但还未出现明显症状,CDR ≤0.5)和常染色体显性遗传AD样本(ADAD),结果显示,在AD症状出现之前,circRNA在多个皮层区域表达出现早期变化,并且circRNA表达的变化在ADAD的情况下也会发生,而且即使根据神经病理学的严重程度进行调整,其变化幅度也只会更大。

3. AD相关circRNA的AD相关性和潜在的疾病影响机制

通过相对重要性分析、共表达网络分析和miRNA结合位点预测分析,与已知的两个因素-APOE4等位基因的数量(AD最常用的遗传风险因子)和神经元估计比例相比,circRNA的变化能更好的反映AD特征(图2);此外,AD相关的circRNA与已知的AD基因存在共表达关系,并且这些circRNA存在潜在的microRNA结合位点,可以用于预测以AD基因为靶点的microRNA(图3)。

circRNA测序-案例1

参考文献

Dube U, Del-Aguila JL, Li Z, et al. An atlas of cortical circular RNA expression in Alzheimer disease brains demonstrates clinical and pathological associations. Nat Neurosci. 2019;22(11):1903-1912. doi:10.1038/s41593-019-0501-5

案例 2

探究与湖羊毛羔皮不同毛型相关circRNA的表达信号

期刊:Genomics 影响因子:6.205 发表时间:2020年5月

研究背景

湖羊以其水波纹似的毛闻名于世,其毛类型和分布位置是评估羊毛质量的重要因素。根据毛卷曲度和宽度,羊毛被分为四个等级包括小波浪、中波浪、大波浪和直形羊毛。其中以小波浪为最佳,直型为最次。已有研究表明circRNA参与大量细胞和生物学过程,但却缺乏与湖羊毛囊发育关联的circRNA研究。

样品来源

采集来自江苏苏州农场6只两日龄全同胞湖羊羔的背部毛根

方案设计

采集6只湖羊羔的背部毛根,根据毛型分为直毛组和小波浪组。当羊毛收集至背侧1/3面积时,提取毛根RNA并进行lncRNA测序,后对湖羊不同花纹羔羊皮毛囊中的差异表达lncRNAs进行分析。

主要结果

1. circRNA差异表达分析

在小波浪型和直形羊毛组的差异分析中共鉴定到55个上调和59个下调的差异circRNAs。其中circSMAD5,circSMD1和circFGFR2的管家基因分别对应Smad5,Smad1和FGFR2。Smad5和Smad1是TGF-β信号通路中的重要基因,这些circRNA可能与TGF-β信号通路有关,甚至与毛囊的生长和发育有关。通过qRT-PCR技术在mRNA水平进行验证,PCR定量结果与RNA-seq结果高度一致。

2. 管家基因的GO与KEGG富集分析

GO富集分析表明,差异circRNAs的宿主基因被富集到2,252个功能亚类,其中有325个显著差异的GO通路。宿主基因的KEGG富集分析注释到64种通路,包括代谢通路(oas01100),TGF-β信号通路(oas04350),ErbB 信号通路(oas04012)等。其中 TGF-β途径,Notch途径和Wnt途径均参与毛囊的生长和发育。

3. 预测circRNAs和miRNAs之间靶向关系

利用MiRanda软件预测miRNA与circRNA的结合位点。结果表明,有129个miRNA可能与114个差异circRNA结合(图3)。相同circRNA上有多个miRNA结合位点,且相同miRNA也靶向多个circRNA。其中miR-10a,miR-125b, miR-143,miR-let-7a,miR-199a-3p,miR-200a,miR-200b对毛囊的生长和发育具有重要影响,它们的靶circRNA可能参与了毛囊的生长和发育。

4. 鉴定circRNAs的编码潜能

使用IRESfinder分析环状RNA的蛋白编码潜能,得到3,556个得分大于0.5的circRNAs。在此基础上,分别使用CPC,CNCI和PFAM软件鉴定了39,307个和2,019个具有编码潜能的circRNA。最终,通过三种软件同时鉴定了11个具有编码潜能的circRNAs。

circRNAseq_案例2

参考文献

Lv X, Chen W, Sun W, et al. Expression profile analysis to identify circular RNA expression signatures in hair follicle of Hu sheep lambskin [published online ahead of print, 2020 Aug 5]. Genomics. 2020;S0888-7543(20)30610-8. doi:10.1016/j.ygeno.2020.07.046

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常见问题
Q1. circRNA测序是单独使用circRNA建库吗?

在建库时,先去除rRNA并用RNase R酶处理去除线性RNA,而闭合环状的circRNA被保留用于后续测序。

Q2. lncRNA测序中circRNA分析与circRNA的 R酶富集建库测序分析的结果有什么区别?

采用R酶富集circRNA建库测序鉴定的circRNA数量在2-3万个,而采用lncRNA测序分析中的circRNA数量是R酶富集建库的十分之一。如果客户集中关注circRNA,推荐circRNA的R酶富集建库方法。

Q3. circRNA测序推荐检测数据量?

单个circRNA 测序推荐10 G数据量,采用Illumina测序PE150 策略。

产品介绍

LncRNA是一类超过200 nt的RNA分子,序列较为保守,通常具有polyA尾巴与启动子结构。其在分化过程中有动态的表达与不同的剪接方式,但它们并不编码蛋白,而是在表观遗传、转录以及转录后水平调控基因表达。lncRNA参与了X染色体沉默,基因组印记以及染色体修饰,转录激活,转录干扰,核内运输等多种重要的调控过程。且大多数的lncRNAs在组织分化发育过程中具有明显的时空表达特异性,且在不同疾病中呈现特异性表达方式,因此广泛应用于疾病机制研究,与人类疾病的发生、发展、防治都有密切关系。

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案例解析
案例 1

鉴定晚期前列腺癌中与雄激素受体因子相关的长非编码RNA

期刊:Communications Biology 影响因子:4.165 发表时间:2020年6月

研究背景

前列腺癌近年来在男性中的发病率呈不断上升势态,严重威胁男性健康,晚期前列腺癌发生转移或者去势抵抗后整体预后更差。长非编码(lnc)RNA在包括前列腺癌细胞在内的癌细胞中具有多种功能,例如表观和基因调控。已有研究报道由lncRNA介导的RNA结合蛋白或转录因子与前列腺癌特定的基因组区域关联。然而,去势抵抗性前列腺癌(CPRC)的分子细胞机制尚不清楚。

样品来源及方案设计

对六例前列腺良性增生,八例局限性前列腺,和六例CPRC癌组织提取RNA并开展RNA测序,联合三类前列腺癌细胞系的ChIP测序数据与RNA测序数据鉴定由雄激素(AR)或其受体调控的AR结合基因。之后用qRT-PCR和western blot来验证雄激素受体阳性前列腺癌细胞中AR的调控和CRPC模型细胞系的AR表达,使用RNA免疫沉淀分析剪接因子与CPRP组织中lncRNA的相互作用。

主要结果

1. CRPC发展中相关基因表达谱

为探究参与前列腺癌发展的基因信号,本研究将CRPC样本与前列腺增生和局限性前列腺癌组织比较,转录本表达量上调的基因归类于Type_A。其中代表性的CRPC标记基因有PCAT, TRIM25/Efp, EZH2, UBE2C和AR(图1)。对1679个Type_A基因功能富集,富集的KEGG通路参与生物学活动,包括DNA复制,细胞周期,剪接和氧化磷酸化。

2. CRPC特异性的AR转录programme

使用ChIP-seq和RNA-seq数据联合分析鉴定三种前列腺癌细胞系中雄激素或受AR调控的AR结合基因。在LNCaP和22Rv1细胞中,分别发现了1748、717个基因被AR调控,在VCaP细胞中AR调控基因大约是前者一半。而从前列腺癌发展至CRPC,AR靶基因的表达具有显著的异质性。在这些AR调控的基因中,发现了CRPC特异性标记基因,例如UBE2C、CDK1和EZH2。在这些基因中,活性启动子和增强子标 记(H3K4me3,AcH3)在AR结合序列显著富集(图2)。

3. 鉴定CRPC中AR调控的lncRNAs

研究发现了AR调控的lncRNA,即CRPC-Lncs(ARL- NC1, HOTAIR, PCAT1),它们在CRPC组织中高度表达。值得注意的是,其中两个lncRNAs(CRPC-Lnc#6: PRKAG2-AS1和#9:HOXC-AS1)的沉默可使CRPC肿瘤生长速度放慢,这显示出AR和AR变体表达的抑制作用。从机理上讲,剪接因子U2AF2活性取决于CRPC-Lnc#6的表达水平,该因子参与亚细胞定位(图3)。该研究突出了可作为参AR考调文节剂献以及CRPC中潜在生物标记物的lncRNA簇。

lncRNAseq_案例1

参考文献

Takayama KI, Fujimura T, Suzuki Y, Inoue S. Identification of long non-coding RNAs in advanced prostate cancer associated with androgen receptor splicing factors. Commun Biol. 2020;3(1):393. Published 2020 Jul 23. doi:10.1038/s42003-020-01120-y

案例 2

鉴定与小鼠年龄相关性听力损失的潜在lncRNA

期刊:Aging 影响因子:5.515 发表时间:2020年3月

研究背景

年龄相关性听力损失(AHL),也被称为老年性耳聋,其特征是由于年龄增长,耳蜗毛细胞、螺旋神经节神经元和血管纹细胞的不可逆性 损伤。lncRNAs通过调节神经元细胞的病理蛋白和离子通道参与神经衰老调控。目前还没有研究指出年龄相关性神经疾病AHL与lncRNAs是否存在关联。本研究探讨了lncRNAs是否参与调控AHL。

样品来源

实验将C57BL/6J小鼠分为两组:6周龄小鼠组和1岁龄小鼠组。细胞实验采用HEI-OC1细胞系

方案设计

提取六周龄和一岁龄小鼠耳蜗组织RNA并测序,分析两组lncRNA差异表达。使用qRT-PCR和western blot验证lncRNA的表达量。最后使用HEI-OC1细胞并敲除靶向 lncRNA NONMMUT010961.2。

主要结果

1. 耳蜗组织LncRNAs/mRNAs差异分析

本研究通过RNA序列分析,分析了lncRNAs和mRNAs在6周龄和1岁龄C57BL/6J小鼠耳蜗中的差异表达。我们发现这两组中分别有738 和2033个lncRNAs和mRNAs差异表达(FDR < 0.05)。本实验关注的与听力损失相关的已知基因和RNA序列中差异表达的34个mRNAs的重合,囊括了声音的感官知觉通路中(GO:0007605)的所有29个基因(图1)。

2. mRNA-lncRNA 共表达网络

为了鉴定与AHL相关的lncRNAs,基于Spearman相关性分析和共表达网络分析,选择了11个同时与听力损失和氧化应激细胞凋亡有关 的lncRNAs来验证RNA-seq数据的可靠性。这11种lncRNA与参与听力损失和氧化应激通路的靶向mRNA的互作如图2所示。结果表明,在

3. qRT-PCR验证lncRNA表达及潜在靶向mRNAs

用qRT-PCR方法验证lncRNAs在AHL动物模型和细胞模型中的表达水平。在这些lncRNAs中,有4个在AHL的动物和细胞模型中都有显著表达差异,其中lncRNA NONMMUT010961.2的差异最为显著。而敲除lncRNA NONMMUT010961.2后,与氧化应激和凋亡相关基因Ar和听力损失相关基因Hgf在HEI-OC1细胞中的表达显著降低(图3)。因此,lncRNAs NONMMUT010961.2可能与AHL相关,这为AHL提供一种新的治疗方法。

lncRNAseq案例2

参考文献

Zhao T, Liu X, Sun Z, et al. RNA-seq analysis of potential lncRNAs for age-related hearing loss in a mouse model. Aging (Albany NY). 2020;12(8):7491-7510. doi:10.18632/aging.103103

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常见问题
Q1. lncRNA 测序对物种有什么要求?

做lncRNA 测序要求物种具有参考基因组且具有完整注释。

Q2. lncRNA 测序建库与转录组测序有什么不同?

常规转录组测序利用mRNA具有Ploy A尾巴的特性,使用oligo dT方法富集mRNA。而lncRNA建库则是去除rRNA构建链特异性文库,该文库可以区分转录本的正反链,挖掘顺式天然反义转录本,使反义转录本定量更加准确。

Q3. lncRNA 测序数据中是否同时有lncRNA和mRNA的表达信息?

lncRNA测序可以同时获得 lncRNA和 mRNA表达量,因此对于有参考基因组且注释完整的物种,选择lncRNA 测序,可同时获得lncRNA和mRNA的表达量。

产品介绍

ATAC-Seq(Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing) 是2013年由斯坦福大学的研究人员开发的用于研究染色质可及性(通常也理解为染色质的开放性)的方法,原理是通过转座酶Tn5容易结合在开放染色质的特性,然后对Tn5酶捕获到的DNA序列进行测序。ATAC-Seq由于所需细胞量少,实验简单,可以在全基因组范围内检测染色质的开放状态,已经成为研究染色质开放性的首选技术方法。 目前,该技术被用于测定特定时空下基因组中所有处于开放状态的序列,分析调控元件,揭示转录因子结合位点以及核小体位置,从而为研究精细化基因表达的调控、DNA印记等提供有效的方法。

实验流程

分析内容

案例解析
案例 1
研究背景

胰岛素分泌受损是2型糖尿病(T2D)的标志,而染色质结构的改变可能导致这种疾病。因此,本案例使用ATAC测序剖析T2D和非糖尿病供体胰岛的染色质开放区域,以研究T2D对人类胰岛开放染色质的影响。

样品来源

瑞典乌普萨拉大学北欧胰岛移植网络的9例非糖尿病供体(对照组)和6名被诊断为T2D供体(实验组)

实验设计

分离、培养胰岛细胞;取约30个新鲜胰岛冷冻(5个供体)或立即用于ATAC测序(5个供体);测序数据整理分析;胰岛的RNA-seq;ATAC-seq数据与公共ChIP-seq数据集联合分析。

主要结果

1. 绘制人类胰岛开放染色质图谱

非糖尿病和T2D组中分别鉴定出57,105和53,284个peaks,一些序列被富集到与胰岛发育分化有关的基因上,例如PDX-1和FOXA2(图1)。其中,大部分peaks的位置接近转录起始位点(TSS)(图2a),在糖尿病和非糖尿病供体的胰岛中,染色质开放区域的基因组分布相似(图2b, c)。

2. 增强子元件和组蛋白修饰注释分析

与活性染色质相关的组蛋白标记(H3K4me1、H3K4me3和H3K27ac)在实验组胰岛peak中富集,但只有一小部分异染色质相关的组蛋白标记(H3K27me3和H3K9me3)与peak重叠(图3),且T2D供体胰岛中的组蛋白修饰和peak之间的重叠与之类似。此外,T2D相关的差异性甲基化区域(DMRs)位于人类胰岛的7412个开放染色质区域,包括PDX1和SLC20A2标注的区域。

3. 转录因子和转录本注释分析

通过ATAC-seq开放染色质区域和胰岛特异性转录因子(TF)相关基因的比对分析,发现研究所涉及的TF相关基因富集于胰岛peaks。此外,本研究共获得60,517个转录本,分为未表达(38,428个)、低表达(7,363)、中表达(7,363)和高表达(7,363)转录本。ATAC-seq 分析中的peaks大部分被注释到高表达的转录本上。

4. T2D和非糖尿病供体的胰岛开放染色质区域差异分析

有1078个peaks在T2D和非糖尿病胰岛供体之间存在差异,其在基因组不同区域的分布比例见图4a,其中有1044个peaks在T2D供体中富集。一些关键TF特异性motif显著富集在peak中(图4b)。

参考文献

Bysani, M., Agren, R., Davegrdh, C., et al., ATAC-seq reveals alterations in open chromatin in pancreatic islets from subjects with type 2 diabetes. Sci Rep 9, 7785 (2019). doi:10.1038/s41598-019-44076-8

案例 2
研究背景

细胞分化由转录因子(TF)活性变化和转录的改变所驱动。目前,可通过探测染色质可及性去推断细胞类型间TF结合的差异研究这一过程。本研究采用转座酶可及染色质测序(ATAC-seq)分析,以描述拟南芥中茎尖分生组织(SAM)干细胞和分化的叶肉细胞在染色质可及性和TF调节网络方面的差异。

样品来源

经实验室培养、转化的拟南芥植株

方案设计

按一定条件培养植物;构建2种质粒(分别为CLV3和RBC基因与NTF基因的结合体);将质粒整合到植物中表达;拍摄记录转化后的植物顶端分生组织或叶片以确定NTF蛋白的表达和定位;用INTACT法分离细胞核;进行ATAC测序;数据分析与可视化。

主要结果

1. 主要不同细胞的染色质开放区域注释

干细胞和叶肉细胞可富集到22,961个相同的THSs,单独在两类细胞表达的转座敏感位点THSs数量分别为5,283和2215个(图1b)。干细胞和叶肉细胞THSs在基因组不同区域上的分布类似(图1c)。此外,两类细胞的表达谱显示,干细胞的ATAC-seq信号在THSs中心区域最强,并向两侧急剧下降。且在叶肉细胞THSs表达较少的区域也能呈现较高的开放性,间接表明在叶肉细胞的染色质可及区域在干细胞也可获得,反之则不然。

2. 细胞富集型THS相关基因分析

结果显示染色质开放性更高的细胞类型可以富集到更多的THSs,位于这些区域附近的基因更有可能呈现出高表达。而与这些基因相关的ATAC-seq peaks大部分位于转录起始位点上游和转录终止位点下游(图2)。

3. motif分析与转录调控网络

本研究分别在干细胞和叶肉细胞富集到23个和129个差异表达转录因子(图3a)。结合干细胞IDD/GATA调控和在叶肉细胞高表达的4个TFs,确定其靶基因并绘制调控网络图(图3b),该图描述了TF间复杂的相互作用(图4)。

参考文献

Sijacic P, Bajic M, McKinney EC, Meagher RB, Deal RB. Changes in chromatin accessibility between Arabidopsis stem cells and mesophyll cells illuminate cell type-specific transcription factor networks. Plant J. 2018;94(2):215-231. doi:10.1111/tpj.13882

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常见问题
Q1. ATAC-seq与ChIP-seq有什么区别?

ChIP-seq 是获取已知蛋白(转录因子)结合位点的方法,ATAC-seq主要是基于开放区域的motif基因序列来预测可能结合的转录因子。ATAC-Seq对样本起始量需求更少(500-50000),获取的信息更多,不但可做全基因组活性图谱,还可以做核小体定位和转录因子结合分析。

Q2. 在送样前有哪些需要注意?什么样本类型为 ATAC-seq 风险建库样本?

ATAC-Seq对细胞活性要求较高,送样前最好检测下细胞活性,尽量送活性(大于70%)较高的新鲜细胞,组织样本需先处理成细胞悬液, 组织样本也可承接,但需要提前评估。 风险样本类型:a) 结缔组织等骨细胞和纤维含量高的动物样本;b)根茎等纤维含量高、种子果实等糖含量高的植物组织样本,这些物质会降低细胞核提取效率;以及冻存时间超过2个月的样本。

Q3. 环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类特殊的内源非编码RNA,它大量存在于真核细胞胞质内,主要由pre-mRNA在可变剪接的过程中,将上游exon的5’端与下游exon的3’端剪接到一起,形成的首尾相接的环状RNA分子。在功能上,circRNA分子富含microRNA(miRNA)结合位点,充当分子“海绵”( miRNA sponge)的作用,进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用,升高靶基因的表达水平;在细胞生长发育,功能代谢和某些病理反应中发挥重要的调控作用。例如,circRNA可以作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)结合胞内miRNA,通过circRNA-miRNA-mRNA的途径来阻断miRNA对其靶基因的抑制作用。除此以外,circRNA也具有调控其他类型RNA、调节蛋白质活性等功能。ATAC-seq是否需要设置生物学重复?对于生物学重复组的取样建议有哪些?

建议每个分组中设置至少3个生物学重复,来获得更准确的结果,如生物重复间个体差异大的,可增加生物学重复数量。取样过程中,应减少人为造成的样品间差异,具体可以采取如下措施:取样时间、部位、处理条件、性别、年龄、操作过程等方面尽可能保持一致,否则会影响实验结果的可重复性和可信度。

产品介绍

染色质免疫共沉淀(ChIP)是在体内环境中研究蛋白质与DNA相互作用的经典实验方法,广泛应用于组蛋白修饰、特定转录因子的基因调控作用等相关领域。随着新一代测序技术的发展和成熟,染色质免疫沉淀实验与高通量测序的整合——染色质免疫共沉淀测序(Chromatin Immunoprecipitation Sequencing,ChIP-Seq),可在全基因组范围对蛋白结合位点进行高效而准确的筛选与鉴定,同时也为研究的深入开展打下基础。

采用特异性抗体对目的蛋白进行免疫沉淀后,分离与其结合的基因组DNA片段,再通过高通量测序与数据分析,在全基因组范围内寻找目的蛋白的DNA结合位点,并且可以基于多个样品进行差异比较。

ChIP测序-产品应用

实验流程

ChIP测序-实验流程

分析内容

ChIP测序-分析内容

案例解析
案例 1
研究背景

弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是一种异质性疾病,已被区分为至少两个亚组,即生发中心B细胞样(GCB)亚型和活化B细胞样(ABC)亚型。在大约四分之一的DLBCL病例中观察到ch11q24.3反复增加,这导致两个ETS转录因子家族成员ETS1和FLI1的过表达。本研究利用siRNA使ETS1的表达沉默,并结合ChIP-seq数据分析表达变化,以鉴定ETS1直接调控的基因。

实验设计

标准条件下培养细胞系后获得ABC和GCB表型的DLBCL细胞系,并在一定条件下培养HEK293T细胞;敲除B细胞的ETS1基因;构建shRNA慢病毒质粒,并对HEK293T细胞进行瞬时转染;鉴定细胞活力;提取细胞RNA;反转录后进行qRT-PCR;进行western blot验证转染后细胞;进行染色质免疫共沉淀和转录组分析。

主要结果

1. 敲除实验鉴定ABC-DLBCL中由ETS1调控的基因

参与浆细胞分化、HIF1α靶点调控和BCR激活基因下调的转录本受ETS1的负调控。参与调控BCR信号、CD40信号、NFκB/TNFα通路、免疫应答以及早期分化的基因的转录本受ETS1的正调控。此外,结果表明参与RNA加工的基因在敲除ETS1后富集。

2. 与ChIP-Seq 数据联合分析证实推测的ETS1直接靶点,并发现它们与BCL6、BLIMP1和PAX5靶点重叠

已有研究利用人类B细胞淋巴母细胞ChIP-Seq数据获得6760个假定的ETS1基因靶点,该结果与本实验鉴定的224个转录本重叠。其中,本研究RNA-seq鉴定出的97个被ETS1正调控、12个被负调控的基因与ChIP-Seq推测的ETS1靶点重叠(图1A)。

3. 新的ETS1靶点FCMR主要在ABC-DLBCL中表达

FCMR是在敲除ETS1后表达量下调最多的基因之一,且在启动子处与ETS1结合,表明FCMR是ETS1的直接靶点。在ABC-DLBCL细胞系中检测到FCMR,在GCB-DLBCL细胞系中未见(图2A),且ABC-DLBCL细胞的FCMR mRNA水平也高于GCB-DLBCL细胞(图2B)。此外,在不同的DLBCL临床标本中,ABC-的FCMR表达始终高于GCB-DLBCL(图2C)。

4. FCMR基因功能分析

在两个细胞系(TMD8和HBL1)中分别独立使用两个shRNA (sh62C和sh62D)抑制FCMR的表达。结果显示敲除FCMR使pETS1和pAKT(Ser473)磷酸化水平下降,并显著影响细胞的增殖。

ChIP测序-案例1

参考文献

Priebe V, Sartori G, Napoli S, Chung E Y et al. Role of ETS1 in the Transcriptional Network of Diffuse Large B Cell Lymphoma of the Activated B Cell-Like Type. Cancers. (2020). doi: 10.3390/cancers12071912

案例 2
研究背景

许多经过人工选择、驯化的作物与它们的野生祖先相比,植株分蘖大大减少,顶端优势增加。这使得作物积累更多的能量用于营养生长阶段。在玉米中,分蘖数的减少是由于功能获得突变等位基因TB1发挥作用。顶端优势主要是侧生分生组织被生长素途径抑制的结果,故这个过程与植物激素密切相关。但TB1显性等位基因增加顶端优势的具体机制尚不清楚。本研究针对该问题展开研究,旨在解析TB1调控的下游基因以及它所参与的代谢通路。

方案设计

获取玉米自交系B73(对照组)和TB1突变的B73植株(实验组)的腋芽组织;提取RNA;分别进行mRNA-seq与ChIP-seq;进行qRT-PCR验证RNA-seq结果;进行EMSA、ChIP-qPCR验证ChIP-seq结果;使用HPLC-MS分析腋芽的激素和糖类物质组成;构建由基因到转录到代谢到表型的代谢通路。

主要结果

1. TB1调节植物激素相关基因以及糖类代谢相关基因的表达水平

与对照组相比,TB1突变的B73植株中的脱落酸、茉莉酸的合成、降解、信号转导相关基因表达量下调,与糖类代谢相关的基因也发生了差异表达。这些基因在不同阶段(B10,B12,B14,gt8,gt12,tb12)的表达谱如图1所示。

2. TB1调节植物激素与糖类物质的含量水平

与对照组相比,TB1突变的B73植株中的脱落酸、茉莉酸和它们的同系物(OPDA、JA-ILE)含量降低,相反蔗糖、果糖、6-磷酸葡萄糖的含量升高(图2)。

3. TB1整合了多个驯化位点

TB1的主要结合区域为Promotor区(图3),从peak中鉴定出了多个与植物株型相关的基因gt1、tga1、tru1,并且鉴定出Binding-Motif GGNCCC(图4a)。GO分析表明,ChIP-seq Peak与差异表达基因重叠部分的基因主要与植物的光响应,激素合成途径,糖类合成等途径相关(图4b)。最后,发现TB1可以结合在自己的远端调控区调节自身的表达(图4c)。

4. 鉴定circRNAs的编码潜能

使用IRESfinder分析环状RNA的蛋白编码潜能,得到3,556个得分大于0.5的circRNAs。在此基础上,分别使用CPC,CNCI和PFAM软件鉴定了39,307个和2,019个具有编码潜能的circRNA。 最终,通过三种软件同时鉴定了11个具有编码潜能的circRNAs。

ChIP测序-案例2

参考文献

Dong, Z., Xiao, Y., Govindarajulu, R. et al. The regulatory landscape of a core maize domestication module controlling bud dormancy and growth repression. Nat Commun 10, 3810 (2019). doi:10.1038/s41467-019-11774-w

送样建议

常见问题
Q1. 哪些物种可以做ChIP-Seq?

基因拼接至染色体水平,且注释完整的2倍体物种即可做ChIP-Seq。

Q2. Input样本和IP样本分别是什么?有什么作用?

Input样本是在进行免疫沉淀前取的一部分断裂后的染色质(不进行免疫沉淀),是断裂后的基因组DNA,IP样本是经过免疫沉淀过程后获得的DNA。这两种样本都要经过逆转交联、DNA纯化、以及后续检测。Input样本可作为对照去排除背景噪音、去验证染色质断裂和整个实验中IP效果,因此,Input对照是ChIP实验必不可少的。

Q3. 哪些因素会影响ChIP-Seq的结果?

抗体的质量与特异性、需要富集的目标区域在基因组上的比例、ChIP的实验操作、DNA片段长度范围、测序通量、测序质量等都会影响ChIP-Seq的结果。

产品介绍

N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)是真核生物mRNA最普遍的一种甲基化修饰,主要富集在mRNA的启动子区、终止密码子区以及RRACH motif内。m6A甲基化修饰在mRNA的剪接、出核、定位、翻译等方面扮演重要角色,对于细胞分化、生物发育和压力应答等过程意义重大。

MeRIP-seq(RNA甲基化测序)是利用m6A特异性抗体免疫共沉淀捕获细胞内具有m6A修饰的RNA片段,并对富集的RNA片段进行高通量测序,以在全转录组范围内对发生m6A修饰区域的进行系统检测、研究的技术。

MeRIPseq_产品应用

实验流程

MeRIPseq_实验流程

分析内容

MeRIPseq_分析内容

案例解析
案例 1
研究背景

肠道微生物群调节宿主的生理机能和基因表达的机制尚不明确。本研究使用MeRIP-seq技术鉴定携带常规的微生物(CONV)、改良的微生物、以及不携带微生物(GF)的小鼠的mRNA中m6A修饰情况,以检查宿主表观转录组标记是否受肠道微生物影响。

样品来源

C57BL/6J鼠购自Charles River;由C57BL/6J鼠产生无菌鼠(来自法国奥尔良CNRS TAAM UPS44或巴斯德研究所的细胞生物学平台);常规鼠在特定的无病原体条件下饲养获得。

实验设计

培养细菌;在一定光周期下处理实验小鼠;制备三组小鼠;提取总RNA后获取纯净的mRNA;分析核苷成分;对制备RNA的组织进行WB实验;进行蛋白组学分析;进行m6A甲基化mRNA的免疫沉淀;qRT-PCR扩增;制备文库并进行MeRIP-seq;m6A peak检测;差异甲基化和表达分析;motif分析;16S rRNA测序;定量与数据分析。

实验结果

1. 盲肠和肝脏中m6A的修饰概况

从盲肠和肝脏样本中检测到大量m6A修饰的peak,且在很大程度上与参考数据库重叠(图1a),盲肠中m6A修饰主要存在于mRNA的CDS和3’ UTR 区(图1b),热图展示了motif在5’ UTR区、CDS区 以及 3’ UTR区的存在情况(图1c)。

2. 肠道微生物控制小鼠盲肠中的m6A修饰

MDS分析显示CONV和GF鼠的盲肠m6A peak分类明显(图2a),分层聚类热图显示CONV和GF鼠盲肠转录本差异显著(图2b)。

3. 不同的细菌种类影响m6A的修饰

接种了不同单一菌群的小鼠(Am与Lp组)的m6A修饰显著与GF鼠和abx鼠(被抗生素处理的CONV鼠)分离,并自成一簇(图2a)。热图中Am和Lp组能更明显地从GF和abx组中单独聚类(图2b)。

4. 微生物群在代谢和炎症通路中调控m6A

肠胃疾病、癌症以及免疫系统疾病均受Am和Lp的显著影响(图3)。Lp诱导参与细胞功能和维持、细胞组装和基因表达等转录本的差异甲基化,影响与细胞生长、增殖、凋亡相关转录本的甲基化。Am影响参与RNA转录后修饰的转录本。

MeRIPseq_案例1

参考文献

Jabs, S., Biton, A., Bécavin, C. et al. Impact of the gut microbiota on the m6A epitranscriptome of mouse cecum and liver. Nat Commun 11, 1344 (2020). doi:10.1038/s41467-020-15126-x

案例 2
研究背景

结直肠癌(CRC)是全球肿瘤相关死亡的主要原因之一,其主要致死原因是远处转移。甲基转移酶样蛋白14抗体(METTL14),一种主要的RNA N6-腺苷-甲基转移酶,通过调节RNA功能参与肿瘤发展。本研究旨在揭示METTL14在CRC中的生物学功能及分子机制。

样品来源

NCM460、HCT116、HCT8、SW620、SW480、HT29、DLD-1细胞系均取自American Type Culture Collection(ATCC)。

实验设计

进行qRT-PCR、WB以及免疫组化(IHC)实验检测CRC细胞系与组织中的SOX4和METTL14;用体外、体内实验证明METTL14的生物学功能;用ChIP、RNA-seq、MeRIP-Seq、RNA免疫沉淀和荧光素酶报告基因揭示METTL14的作用机制。

实验结果

1. METTL14在CRC中低表达,并与CRC发展相关

CRC组织中METTL14的表达水平显著低于非肿瘤组织(图1),且CRC组织中METTL14在mRNA和蛋白水平上的表达均显著高于癌旁正常组织(图2a-b),这与淋巴结转移、远处转移以及TNM分期显著相关。METTL14低表达的CRC患者总生存率(OS)低(图2c)。

2. KDM5C介导的脱甲基化H3K4me3抑制METTL14的转录

CRC细胞中启动子区H3K4me3的富集明显低于正常结直肠组织。KDM5C(催化H3K4me3脱甲基化来抑制基因转录)的mRNA表达在CRC组织中显著上调,且研究结果显示METTL14的表达与KDM5C的表达显著负相关。

3. METTL14抑制CRC细胞迁移、侵袭和转移

过表达METTL14会显著阻碍HCT116和HCT8细胞的迁移能力,并抑制这两种细胞的侵袭能力。敲除METTL14会显著提高HCT116和HCT8细胞的迁移速度,并增强它们的侵袭能力(图3)。

4. SOX4是METTL14的下游靶点

在METTL14敲除的HCT116和HCT8细胞中,SOX4在mRNA和蛋白水平上均显著上调。MeRIP-seq结果显示,未敲除METTL14时,m6A peak 出现在SOX4 mRNA终止密码子附近,敲除METTL14后m6A peak减少(图4)。

5. METTL14敲低通过m6A-YTHDF2-依赖的途径提升SOX4 mRNA的稳定性

野生型(有m6A修饰)而非突变型(无m6A修饰)SOX4的转录水平随METTL1的缺失而增加,说明对METTL14依赖m6A修饰调控SOX4水平(图5)。此外,METTL14可以将YTHDF2(SOX4的靶点)上调到SOX4 mRNA的 m6A修饰位点,调节SOX4的表达。

MeRIPseq_案例1

参考文献

Chen, X., Xu, M., Xu, X. et al. METTL14-mediated N6-methyladenosine modification of SOX4 mRNA inhibits tumor metastasis in colorectal cancer. Mol Cancer 19, 106 (2020). doi.org/10.1186/s12943-020-01220-7

送样建议

MeRIPseq_送样建议

常见问题
Q1. MeRIP-seq的送样有哪些注意事项?

(1) 首先要确保送样物种有参考基因组,且基因组拼接至染色体水平、注释完整(基因水平,有外显子、内含子、 CDS)。

(2) 取下组织样品后,快速用RNase-free配制的生理盐水/PBS清洗表面污渍,并吸干表面的液体,迅速将样本分割小块(长宽高 ~0.5 cm),将样本放入已标记好名称且预冷好的Rnase-free的螺纹管中(不要将盖子拧的太死,以免从液氮中取出时破裂),迅速投入液氮中速冻1小时以上,然后取出置于-80℃保存,干冰运输。若实验室无液氮,则需提前准备好存有1 mL RNAfixer的1.5 mL EP管(RNase-free)。在分割成小块后,迅速投入提前准备好的EP管中,使样本完全浸没在液体中,然后置于-80℃中保存,干冰运输。

(3) 实验操作过程中请务必确保无RNA酶污染。为确保实验顺利,建议样品备份1~2 份(以防备部分样品降解重新取材、制备或送样,耽误时间,也防止RNA得率低而导致总量不足)。

Q2. Input和IP样本分别是啥?为什么MeRIP-seq需要同时测这两种样本?

IP 样品是用m6A 抗体特异性富集甲基化修饰的 RNA片段,Input仅仅是片段化的 RNA(用作消减背景噪音的对照),二者需同时进行建库和测序。需整合两个样本的数据进行峰检测分析,利用Input数据排除本底表达水平高或非特异性结合的Peaks,以提高Peak Calling的准确性。

产品介绍

代谢组学(metabonomics/metabolomics)是通过考察生物体系受刺激或扰动前后所有小分子代谢物及其含量的变化或其动态变化,来研究生物体系的一门科学。

代谢组学主要包括靶向(Targeted)代谢组学和非靶向(Untargeted)代谢组学两个基本研究方法。靶向代谢组学即目标性代谢组学或定量代谢组学,仅对感兴趣的目标性代谢物进行同时定量分析的代谢组学。非靶向代谢组学即非目标代谢组学或发现代谢组学,无偏向性地对所有小分子代谢物同时进行检测分析的代谢组学。

代谢组学-产品应用

实验流程

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分析内容

代谢组学-分析内容

案例解析
案例 1

靶向代谢组学揭示超营养剂量硒调节猪肝脏中糖和酰基肉碱代谢平衡

期刊:The Journal of Nutrition 影响因子:4.218 发表时间:2019年4月

研究背景

硒(Se)是人类和其他动物健康必需的微量元素,在氧化还原调节、免疫和甲状腺激素代谢中起重要作用。在硒素充足的个体中,超营养量补充可能危害健康。目前,过量硒摄入诱发的代谢紊乱(如2型糖尿病)已引发极大关注,但其潜在的机制尚不明了。因此,本文利用靶向代谢组学分析研究高硒素摄入量是否会导致猪出现2型糖尿病,并检测肝脏硒蛋白基因表达、氧化还原状态、糖和酰肉碱代谢对高硒素补充的反应。

样品来源

实验室按一定条件喂养的雄性猪

方案设计

三十六头雄性猪(62.0 ± 3.3 kg)被随机分为两组(6重复/组,3头/重复);分别将两组饮食中硒的终浓度补充至0.25 mg Se/kg(Se-A组)、2.5 mg Se/kg(Se-S组),饲喂60天;实验30、60 天后,禁食12h并采血样;实验结束时,电击处死并放血,迅速收集肝脏、半腱肌、心脏和肾脏;测定Se浓度、血清生化以及肝脏酶活性;检测硒蛋白mRNA表达;进行靶向代谢组学分析。

主要结果

1. 超营养剂量硒对猪生长性能、猪体内硒浓度以及血清生化反应的影响

两组间猪的日增重、日采食量和饲料转化率无显著差异。Se-S组血清Se浓度是Se-A组的2.7倍(30 d)和3.1倍(60 d);Se-S组中肝脏、肌肉、心脏和肾脏组织中的Se浓度分别是Se-A组的4.2、6.7、5.4和2.0倍(图1);两组血清TC、TG、HDL胆固醇、LDL胆固醇浓度的差异不显著。Se-S组空腹血糖浓度、血清胰岛素和FFA浓度均显著高于Se-A组(图2)。

2. 超营剂量硒的补充对肝脏mRNA水平、以及对肝糖、乙酰肉碱代谢和酶活性的影响

超营养补充Se显著影响硒蛋白基因(GPX4、TXNRD1和SELENOW)的表达(图3)。Se-S组葡萄糖、延胡索酸、苹果酸等相对含量均显著高于Se-A组。LC-MS/MS结果显示,Se-S组肉碱、己酰肉碱、癸酰基肉碱和十四烷酰基肉碱的相对含量均显著高于Se-A组。Se-S组的PEPCK活性显著高于Se-A组,但己糖激酶活性和SDH活性显著低于Se-A组。

3. 高SeMet补充通过调节糖代谢和脂质合成诱导高血糖和高胰岛素血症

通路分析结果显示,食物中高SeMet诱导的高血糖和高胰岛素血症与猪肝脏中糖代谢的抑制和脂质合成的升高有关(图4)。

代谢组学-案例1

参考文献

Zhang K, Han Y, Zhao Q, et al. Targeted Metabolomics Analysis Reveals that Dietary Supranutritional Selenium Regulates Sugar and Acylcarnitine Metabolism Homeostasis in Pig Liver. J Nutr. 2020;150(4):704-711. doi:10.1093/jn/nxz317

案例 2

利用靶向代谢组学鉴定枇杷的主要味道成分

期刊:Food Chemistry 影响因子:6.306 发表时间:2020年4月

研究背景

枇杷可分为白肉和黄肉两种。一般来说,白色肉质品种比黄色肉质品种风味更佳。目前,由于缺乏对枇杷果实代谢物的大规模、全面的研究,其口感差异的代谢原因尚不清楚。本文基于LC-MS/MS对“白肉”和“枣中号”两个品种进行靶向代谢组分析。

样品来源

样本分别来自广州水果科学研究所五年生的白色肉质的“白玉”和黄色肉质的“枣中6号”

方案设计

果实提取物采用LC-ESI-MS/MS进行分析,以确定和量化代谢产物,包括碳水化合物,有机酸和氨基酸。

主要结果

1. 枇杷的靶向代谢物鉴定

通过靶向测定,共鉴定出536种代谢物,其中包括可能影响口感的大量代谢物(21种碳水化合物、60种有机酸和28种氨基酸)以及其他初级和次级代谢物。

2. 多因素分析鉴定代谢物

对536个代谢物进行PCA分析,两个品种和质量控制(QC)样品明显分离(图1A)。为了消除数量对模式识别的影响,对每个代谢物的峰面积使用log10转换,然后进行层次聚类分析。分析揭示了两个明显与“白玉”和“枣中6号”相关的群体聚类(图1B)。以上结果表明,这两个品种具有不同的代谢物谱。

为了鉴别两组的差异代谢物,本研究选择相比“白玉”,在“枣中6号” Fold change ≥1.6(上调)或 ≤0.625(下调)的代谢物。利用OPLS-DA模型(VIP≥0.8)对差异代谢物进行筛选。共鉴定两个枇杷品种间的193种差异代谢物。与“白玉”相比,“枣中6号”有68种代谢产物下调,125种代谢产物上调(图2A)。193种代谢物可分为20多个不同类别(图2B),但大多数为碳水化合物、有机酸、氨基酸、氨基酸衍生物、酚类和脂类。

3. 差异代谢物的KEGG分类和富集分析

KEGG通路富集分析表明两种植物途径(“类黄酮生物合成”和“黄酮和黄酮醇生物合成”)在两种栽培品种间差异显著(p <0.05)。

4. 碳水化合物,有机酸和氨基酸分析

21种与味道相关的碳水化合物在两个枇杷品种中均得到鉴定,7种糖被鉴定。“枣中6号”的麦芽四糖含量显著高于“白玉”,但两者的相对丰度均较低。两个品种中共鉴定了60种有机酸,其中12个差异累积量均有显著差异。共鉴定了28种氨基酸,其中8种累积差异较大,3种氨基酸,L-谷氨酰胺、L-瓜氨酸和L-(+)-赖氨酸的浓度在品种间存在显著差异。

代谢组学-案例2

参考文献

Zou S, Wu J, Shahid MQ, et al. Identification of key taste components in loquat using widely targeted metabolomics [published online ahead of print, 2020 Apr 18]. Food Chem. 2020;323:126822. doi:10.1016/j.foodchem.2020.126822

案例 3

代谢动力学预测婴儿胎龄及孕妇分娩时间

期刊:Cell 影响因子:38.673 发表时间:2020年6月

研究背景

怀孕期间的新陈代谢是一个动态、精确的程序化过程,代谢异常则会给母亲和胎儿带来严重后果。目前,孕期和预产期主要是通过母亲妊娠前最后的月经时间和超声波检测来确定。然而,前者的问题在于准确率太低,而后者尽管较为精确但对于时间的要求比较高。因此,开发出一套精确且可实现的孕期检测方法显得尤为重要。

样品来源

对30名丹麦妊娠女性从怀孕第5周到产后期每周抽取血样,随机抽选784份样本用于研究

方案设计

通过液相色谱-质谱法(LC-MS)对来自30名受试者不同时间点代谢物进行定性定量分析。此外本研究利用线性回归方法LASSO对21个受试者的代谢物和其产期关联构建代谢钟模型,后利用该模型对9个已知受试者产期进行预测及结果验证。

主要结果

1. 非靶向代谢组学根据胎龄精确聚类每周血浆样本代谢物

利用非靶向代谢组对30个受试者在不同时间点的代谢物分析,共鉴定出9651种代谢产物,其中,4995种在怀孕期间和产后发生了改变,176种与妊娠显著相关,其中68种代谢产物在妊娠期间的变化超过50%(图1),且在这些代谢物中,功能代谢组(例如类固醇、溶菌酶、脂肪酸和咖啡因代谢物)在妊娠期间变化一致,且组内化合物互相作用。

2. 孕期代谢通路精细调控

通过对代谢物功能KEGG分析,发现妊娠期代谢化合物注释到的48条代谢通路中有34条发生了显著变化。其中,类固醇激素的生物合成在妊娠时增强,在妊娠结束前达到峰值,在分娩后急剧下降。事实上,母亲为了适应妊娠反应,其对代谢通路的调控在妊娠前后发生了明显变化。

3. 用机器学习方法鉴定正常妊娠的代谢时钟及结果验证

本研究建立了具有五个代谢物的代谢时钟,其结果与超声波检测的胎龄高度符合(R = 0.92)(图3)。此外,本研究还验证了利用少数代谢物预测分娩时间的准确性,即两到三种代谢物就能确定何时分娩(分娩时间在两周、四周和八周内,AUROCR R 0.85)(图4)。通过检测不同个体的代谢时钟预测性能,发现对于大多数人来说,该模型预测与妊娠早期超声所估计的胎龄一致,少数人具有预测偏差,可能与婴儿出生体重密切相关。

代谢组学-案例3

参考文献

Liang L, Rasmussen MH, Piening B, et al. Metabolic Dynamics and Prediction of Gestational Age and Time to Delivery in Pregnant Women. Cell. 2020;181(7):1680-1692.e15. doi:10.1016/j.cell.2020.05.002

案例 4

全氟辛烷磺酸钠对拟南芥叶片代谢特性的影响

期刊:Science of the Total Environment 影响因子:6.551 发表时间:2019年11月

研究背景

全氟辛烷磺酸(PFOS)是一种稳定、耐降解的新型环境污染物。全氟辛烷磺酸污染普遍存在于全球生态系统中,例如野生动物,植物。由于其广泛的应用和持久性,在生物和非生物样品,如小麦、双壳类和玉米中都检测到了PFOS。PFOS对动物的毒性已有报道,但其对植物毒性的潜在机制却鲜有报道。

样品来源

将消毒后野生型 种子分别接种到PFOS浓度为1.00、0.01、0mg/L的培养基中,每组30个样本,于无菌培养箱培养30天后采集叶片。

方案设计

对高、低浓度PFOS实验组和对照组采集的30个叶片分别利用气相色谱质谱对代谢物进行定性和定量分析。后对三个组进行代谢物差异分析,找出显著性差异代谢物及相关通路。主要结果:

主要结果

1. 代谢组学评价PFOS对毒性

根据所有代谢物的PCA和OPLS-DA分析,发现53个生物标志物显著变化(P <0.05,VIP <1),其中21种代谢物的浓度增加,32种代谢物的浓度降低。除谷氨酸外的所有氨基酸都受到抑制,可能与蛋白质结合有关,植物激素中的生长素和细胞分裂素显著下调。

2. PFOS对代谢通路的干扰

在对PFOS氧化应激的反应机制中,苯丙素途径被充分激活(香豆酸、咖啡醛、松柏醛和芥子酸),产生多种多酚类物质,这些多酚类物质进一步增强为抗活性氧(ROS)的黄酮类化合物,作为主要的防御途径,此外抗坏血酸,海藻糖和烟酰胺也被激活,这有助于减少氧化应激的损害(图2)。

3. 全氟辛烷磺抑制细胞分裂素

全氟辛烷磺对拟南芥叶中的大部分细胞分裂素表现出抑制作用,腺苷水平的降低直接导致异戊烯二烯酸水平的降低。这种效应进一步抑制了顺式-玉米素核糖苷和反式-玉米素核糖苷的生物合成,并且顺式-玉米素生物合成速度也被还原的前体所抑制,导致这些化合物的含量降低。

代谢组学-案例4

参考文献

Guo Q, He Z, Liu X, Liu B, Zhang Y. High-throughput non-targeted metabolomics study of the effects of perfluorooctane sulfonate (PFOS) on the metabolic characteristics of A. thaliana leaves. Sci Total Environ. 2020;710:135542. doi:10.1016/j.scitotenv.2019.135542

送样建议

代谢组学-送样建议

常见问题
Q1.代谢组学选取什么类型的样本?样本如何处理?

一般而言,代谢组学样本的类型多种多样,常见的有以下几大类:血清、血浆、尿液、粪便、细胞、细菌、组织、培养液、植物的花、茎、叶等。样本处理和采集要遵循“保持最鲜活状态”的原则,采集样本后立即通过置于液氮、干冰或-80。C冰箱中,阻止样本离体后的进一步代谢活动,并保证样本在实验前一直处于-80。C以下。

Q2.如何设计样本的生物学重复?

代谢物处于生命活动的下游,相对于基因和蛋白,其动态波动性大。因此需要很多生物学重复来增加数据的可靠性。靶向代谢组学,一般是用于验证的,所以生物学重复的个数越多,最终的结果越可靠,一般,每组至少3个生物学重复。非靶向代谢组学,一般细胞/微生物样本每组至少6个生物学重复,模式动物/植物样本至少10个生物学重复,临床样本每组至少30个生物学重复,样本重复数量建议大一6个,过少,后续多元统计模型容易过拟合,统计结果不可靠。

产品介绍

虚拟筛选(Virtual Screening,VS)是基于小分子数据库开展的活性化合物筛选。利用小分子化合物与药物靶标间的分子对接运算,虚拟筛选可快速从几十至上百万分子中,遴选出具有成药性的活性化合物,大大降低实验筛选化合物数量,缩短研究周期,降低药物研发的成本。据报道虚拟筛选的阳性率为5%-30%,利用虚拟筛选成功辅助药物设计的案例逐年增多,虚拟筛选已成为目前最有潜力的药物开发工具。

虚拟筛选方法主要分为基于受体生物大分子结构的虚拟筛选(structure-based virtual screening, SBVS)和基于配体小分子的虚拟筛选(ligand-based virtual screening, LBVS)两种。

虚拟筛选_产品应用

实验流程

虚拟筛选_实验流程

分析内容

虚拟筛选_分析内容

案例解析
案例 1
研究背景

棘球蚴病(包虫病)是一种严重的人畜共患寄生虫病,对人类健康和畜牧业造成重大影响。然而,临床使用的药物(苯并咪唑)治愈率低,急需替代药物。目前对棘球蚴病的药物筛选主要以表型为主,对活性化合物的识别效率很低。本研究利用活性氨基醇结构生成的药效团模型进行了虚拟筛选以发现具有抗棘球蚴活性的新化合物。

样品来源

BALB/c小鼠来源于SLAC实验动物中心

实验设计

生成并验证药效团模型;基于药效团模型的虚拟筛选;制备E. multilocularis感染的BALB/c小鼠;从感染动物腹腔分离寄生虫物质;棘球蚴原头节(PSCs)的存活率测定与样本筛选;E. multilocularis的体外药物筛选;细胞毒性测试;化合物对E.multilocularis感染小鼠疗效分析;药代动力学分析。

实验结果

1. 药效团模型生成、验证和虚拟筛选

生成10个HipHop模型后,用活性和非活性氨基醇组成的测试集来选择最佳模型,其中药效团模型HipHop-Hypo03最佳(图1C)。该药效团包括一个PI基团、一个HAR基团、两个HAL基团和一个HBD基团(图1A-B)。

2. 评价候选化合物对E.multilocular PSCs的体外活性及其细胞毒性

10 种化合物致使寄生虫在 3 天内 100% 死亡,它们的 LC50 值为 16.99-20.45 μM。暴露于这些化合物会导致寄生虫的形态损伤(图2)。此外,化合物S6、S11、S16和S19 的细胞毒性低,且S5、S6、S11、S16、S19、S28能抑制癌细胞(A172细胞)的增殖。

3. 候选化合物的体内效应

尽管两种剂量(50和25 mg/kg)的化合物S6抑制了小鼠体内E. multilocularis的生长,但与对照组抑制率相比差异不显著(图3)。治疗结果显示,MBZ-25、BTB4-50、BTB4-25、HT3-50、HT3-25分别导致1、4、2、3、2只小鼠死亡,而对照组和S6组小鼠在实验过程中均存活。

虚拟筛选_案例1

参考文献

Liu C, Yin J, Yao J, Xu Z, Tao Y, Zhang H. Pharmacophore-Based Virtual Screening Toward the Discovery of Novel Anti-echinococcal Compounds. Front Cell Infect Microbiol. 2020; 10: 118. Published 2020 Mar 20. doi:10.3389/fcimb.2020.00118

案例 2
研究背景

由快速传播、高传染性和致病性的SARS-CoV-2引起的COVID-19被世卫组织列为全球流行性疾病。2019新型SARS-CoV-2通过病毒表面刺突糖蛋白(S蛋白)与细胞血管紧张素转化酶2(ACE2)受体结合进入宿主细胞。病毒特异性分子与宿主细胞的相互作用是鉴定SARS-CoV-2抗病毒药物的一个有前景的治疗靶点。药物的重新利用可以作为治疗指数扩张的COVID-19的一种快速、潜在的方法。本研究利用高通量虚拟筛选方法研究了抗S-RBD和ACE2宿主细胞受体的LOPAC文库药物,识别出一些或许能有效协助控制SARS-CoV-2的快速传播的分子,并进行了详细分析。

样品来源

SARS-CoV-2靶标序列来自于NCBI

实验设计

S蛋白S1亚基的三维同源模型生成;选择配体库;基于结构的虚拟筛选;分子对接;分子动力学模拟。

实验结果

1. 鉴定ACE2受体结合分子

ACE2在SARS-CoV-2进入宿主细胞中起核心作用,Lys31和Lys353是ACE2上的两个病毒结合热点。因此,以Lys31和Lys353热点残基为中心进行高通量筛选(图1A)。GR 127935盐酸盐水合物、GNF-5、RS504393、TNP和醋酸依非巴肽是得分最高的5种化合物(图1B-F)。

2. 比较ACE2受体和配体之间的分子相互作用

GR 127935盐酸盐水合物显示最高的结合能(-11.23 kcal/mol),与ACE2受体形成2个氢键(图2A)。GNF-5(E = -7.57 kcal/mol)与Lys353通过疏水键相互作用,也显示出对hotspot353的亲和力(图1C,2B)。TNP 、RS504393和醋酸依非巴肽与受体的相互作用见图2C-E。

3. SARS-Cov2的S-RBD结构

采用SWISS MODEL预测了SARS-CoV-2 S蛋白S1亚基的三维模型,并以SARS-CoV-2 S蛋白预融合结构为模板(图3)。

4. SARS-Cov2的S-RBD结合分子的鉴定

选择RMSD值、结合能以及形成氢键和疏水键能力排名前5的分子进行对接。KT203与BMS195614结合能最高,为-8.73、-8.25 kcal/mol,其次 KT185(-8.16 kcal/mol)、RS504393(-7.67 kcal/mol),RS504393也可与ACE2(-8.32 kcal/mol)结合(图4)。

5. 比较S-RBD残基和配体之间的分子相互作用

KT203和BMS195614与负责识别hotspot 31和hotspot 353的残基之间表现出最大的疏水相互作用。KT203通过疏水相互作用与Leu455、Phe486、Tyr489等结合。BMS195614通过H键与Asn487和Ser494相互作用,但通过疏水相互作用与Leu455、Lys458、Cys488等相互作用。

虚拟筛选_案例2

参考文献

Choudhary S, Malik YS, Tomar S. Identification of SARS-CoV-2 Cell Entry Inhibitors by Drug Repurposing Using in silico Structure-Based Virtual Screening Approach. Front Immunol. 2020; 11: 1664. doi:10.3389/fimmu.2020.01664

送样建议

虚拟筛选_送样建议

常见问题
Q1. 在挑选用于虚拟筛选的蛋白PDB文件时,需要注意哪些?

(1) 种属信息:尽量使用与后续实验一致的种属;

(2) 是否带有其他分子:PDB文件中除了蛋白常常带有核酸、多肽、辅酶、小分子化合物(抑制剂、拮抗剂、激动剂、底物)、助溶剂、表面活性剂、金属离子和水分子等等,我们需要了解各自的作用以作取舍;

(3) 口袋是否完整:口袋附近若有残基,则会较大程度影响对接过程,通过预览口袋的3D结构尽量选择具有完整口袋结构的晶体;

(4) 晶体结构的分辨率:结构质量最重要的参数,Resolution数值越小分辨率越高,电子密度图就越清晰和越详细,一般2 Å左右够用,尽量不用大于3Å的晶体;

(5) PDB数据库也有其他的蛋白信息可供查询:例如根据氨基酸序列可以得蛋白的一些基础信息,包括:相对分子质量、氨基酸组成、等电点(PI)、消光系数、半衰期、不稳定系数、总平均亲水性等。在二级结构上则可预测亲水性、抗原性指数以及表面可能性。同时对于研究比较透彻的蛋白,可通过查询或者多序列比对找到口袋位置,同时还可以找到该结晶的拉式图并检查晶体结构的正确性。

Q2. 什么是对接口袋?如何确定对接口袋?

对接口袋是受体中配体结合的可能区域,以口袋形状(开口小、肚子大、能容纳一定体积的分子结构)最为典型,也有如管道状、凹槽状等其他形状。对于蛋白-配体复合物而言,大且深的疏水性空腔对于配体结合至关重要。对于蛋白结构,这一特点便成为各种算法寻找对接口袋/识别结合位点的重要依据和原则。

可通过网站或软件预测,根据软件预测结果,同时观察蛋白,根据经验与文献,综合确认口袋位置。

参考网站:https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/COACH/#opennewwindow

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